Twoja wyszukiwarka

ELŻBIETA SMOGORZEWSKA
LECZENIE GENAMI
Wiedza i Życie nr 9/1996
Artykuł pochodzi z "Wiedzy i Życia" nr 9/1996

Dzieci z wrodzonym niedoborem odporności zwykle umierają wcześnie. Czy terapia genowa da im szansę na długie życie?

Jak wprowadzić gen?
Nie wyrzucać krwi pępowinowej

Wiosną 1993 roku w Zakładzie Immunologii Doświadczalnej i Przeszczepiania Szpiku Szpitala Dziecięcego w Los Angeles dokonano pierwszego na świecie przeszczepienia pępowinowych komórek krwiotwórczych z wprowadzonym do nich prawidłowym genem kodującym enzym deaminazę adenozyny (ADA). Leczono w ten sposób trzy noworodki z wrodzonym zespołem ciężkiego, złożonego niedoboru odporności (SCID), którego przyczyną jest niemożność syntetyzowania enzymu ADA. Ich rodzeństwo zmarło wcześniej z objawami tej samej choroby. Cała trójka małych pacjentów, obecnie trzylatków, żyje i cieszy się dobrym zdrowiem, a wprowadzone do ich komórek geny funkcjonują prawidłowo. Na ostateczną odpowiedź co do skuteczności tego leczenia trzeba jednak poczekać jeszcze kilka lat.

Wrodzony brak ADA jest przyczyną około jednej czwartej przypadków SCID. Niedobór tego enzymu powoduje gromadzenie się toksycznych substancji (metabolitów), na które szczególnie wrażliwe są limfocyty T (grasicozależne) odpowiedzialne za obronę organizmu przed zakażeniem. Nie leczone dzieci umierają w bardzo wczesnym wieku.

Możliwości leczenia niedoboru ADA są ograniczone. Do niedawna metodą z wyboru było przeszczepianie szpiku kostnego, po raz pierwszy zastosowane z powodzeniem u chorego ze SCID w 1968 roku. Macierzyste komórki krwiotwórcze pochodzące ze szpiku brata lub siostry zastępowały w tym przypadku obarczone defektem komórki chorego. Problem jednak polega na tym, że jedynie 20% chorych dzieci ma rodzeństwo o odpowiednich antygenach zgodności tkankowej.

Już w połowie lat siedemdziesiątych zaobserwowano, że przetoczenie krwinek czerwonych zdrowego dawcy odnawia funkcje immunologiczne chorych dzieci. Opierając się na tych obserwacjach, opracowano w latach osiemdziesiątych metodę leczenia polegającą na cotygodniowym domięśniowym podawaniu bydlęcego enzymu ADA sprzężonego z glikolem polietylenowym (PEG-ADA). I ta metoda zastąpienia brakującego enzymu okazała się tylko częściowo skuteczna: jedynie u połowy leczonych obserwowano poprawę, a ponadto niezwykle wysokie koszty (200 - 400 tys. dolarów rocznie) czynią ją niedostępną dla wielu rodzin.

Nową alternatywną metodą leczenia ADA-SCID jest terapia genowa. Polega ona na wprowadzeniu prawidłowo funkcjonującego genu kodującego ADA do komórek chorego, który odziedziczył niepełnowartościową jego kopię. Przeniesiony gen, podejmując właściwą funkcję, zastępuje własny, obarczony defektem.

Ze względów etycznych obecnie w USA zezwala się na wprowadzanie genów tylko do komórek somatycznych, nie rozrodczych, ponieważ w ten sposób nie zmieniamy całkowitej puli genowej człowieka.

Aby zapewnić długotrwały efekt leczenia, wprowadzamy skorygowany gen do komórki długo żyjącej i zdolnej do samoodnowy. Takie wymagania spełnia macierzysta komórka krwiotwórcza, która daje początek wszystkim elementom morfotycznym krwi, obecna w szpiku kostnym, wątrobie płodu, krwi pępowinowej oraz obwodowej. Wprowadzenie genu do komórki macierzystej zapewnia jego obecność we wszystkich komórkach krwi przez całe życie. Zastosowanie własnych komórek macierzystych (przeszczep autologiczny) niweluje niebezpieczeństwo odrzucenia przeszczepu i reakcji przeszczepu przeciwko gospodarzowi.

Problemem jest jednak niezwykle mały odsetek, jaki stanowią komórki macierzyste. Jedna taka komórka przypada na 10 tys. komórek w szpiku i krwi pępowinowej. We krwi obwodowej dorosłego człowieka jest ich od stu do kilkuset razy mniej. Obecnie potrafimy te komórki izolować i zagęszczać, wykorzystując ich markery powierzchniowe (receptory komórek można znakować przeciwciałami monoklonalnymi) oraz kolumny immunomagnetyczne lub sortujące cytometry przepływowe.

Drugą poważną przeszkodą do pokonania jest "stan spoczynku", w jakim znajdują się komórki macierzyste, retrowirusy wnikają bowiem tylko do komórek dzielących się. Ale i tę przeszkodę udaje się pokonać. Komórki te można zmusić do podziałów in vitro, pobudzając je pewnymi substancjami biologicznie czynnymi tuż przed lub w trakcie spotkania z wektorem retrowirusowym.

Wybór dzieci z niedoborem deaminazy adenozyny (ADA-SCID) do pierwszego eksperymentalnego leczenia genowego z użyciem ich własnych komórek pochodzących z krwi pępowinowej nie był przypadkowy. Schorzenie to można rozpoznać przed urodzeniem dziecka, co umożliwiło zmobilizowanie całego zespołu do zabiegu. W trakcie porodu pobrano krew pępowinową, wyizolowano odpowiednie komórki macierzyste nazwane CD34+. Hodując je przez 3 dni in vitro i zmuszając do podziałów, wprowadzono do nich wektor retrowirusowy niosący prawidłowy gen ADA. Następnie modyfikowane genetycznie komórki podano dożylnie noworodkom.

Naturalnie cały ten zabieg został poprzedzony wieloletnimi badaniami, a także pierwszą próbą kliniczną wykonaną przed pięciu laty, w której ten sam wektor zastosował współpracownik i konsultant naszego zespołu badawczego R. Michael Blease z Narodowego Instytutu Zdrowia (NIH). Leczył on dwie dziewczynki z ADA-SCID, wprowadzając gen ADA do obwodowych limfocytów T (również przeszczep autologiczny). Obie dziewczynki, jedna ma dziś 10 a druga 15 lat, są zdrowe i chodzą do szkoły. Ze względu jednak na krótki czas życia limfocytów zabieg musi być u tych dzieci powtarzany co 6 miesięcy do 2 lat. Równocześnie otrzymują one nadal leczenie zastępcze typu PEG-ADA.

Schemat terapii genowej u noworodka

Wprowadzenie genu do "nieśmiertelnej" komórki macierzystej ma zapewnić całkowite wyleczenie po zabiegu jednorazowym. Proces różnicowania komórek macierzystych jest jednak bardzo powolny, dlatego też na odpowiedź czy przeprowadzona terapia genowa okaże się klinicznie skuteczna trzeba czekać wiele miesięcy, a nawet lat.

Przez ostatnie 3 lata cała trójka dzieci leczonych w naszym szpitalu jest uważnie obserwowana. W pobieranej co miesiąc krwi obwodowej, a po upływie każdego roku życia również w szpiku kostnym, badamy zarówno obecność, jak i aktywność wektora. Ponieważ leczenie to ma charakter zdecydowanie eksperymentalny, ze względów etycznych dzieci nadal otrzymują cotygodniowe wstrzyknięcie PEG-ADA, chociaż dawka została ostatnio zmniejszona do połowy. Nie wiadomo więc na pewno, w jakim stopniu działanie wprowadzonego genu, a w jakim leczenie substytucyjne enzymem wpływa na dobry stan kliniczny dzieci.

Z badań na zwierzętach wynika, że uzyskanie 10% normalnego poziomu aktywności enzymu deaminazy adenozyny wystarcza, aby ustąpiły objawy ciężkiego złożonego niedoboru odporności.

Jedno jest pewne - nie zaobserwowano żadnych objawów ubocznych zastosowanego leczenia. Takie niekorzystne efekty są podstawowym elementem branym pod uwagę przy udzielaniu zezwoleń na eksperymentalne protokoły kliniczne. Zgody musiały udzielić, oprócz rzecz jasna rodziców i komisji etycznej szpitala, także FDA (Food and Drug Administration) oraz specjalnie utworzona przy NIH Doradcza Komisja do spraw Rekombinacyjnego DNA.

Opisana technika znajdzie wkrótce znacznie szersze zastosowanie. W trakcie zatwierdzania są już bowiem protokoły kliniczne terapii genowej innych schorzeń wrodzonych, takich jak hemofilia czy niedokrwistość sierpowata, lub nabytych, jak AIDS, w tym leczenie dzieci, których matki są nosicielkami HIV. W przygotowaniu jest także projekt takiego leczenia stosowanego jeszcze przed urodzeniem - w łonie matki.

JAK WPROWADZIĆ GEN?

Istnieje wiele metod wprowadzania genu terapeutycznego do komórki, jednak żadna nie jest idealna. Obecnie najczęściej wprowadza się geny za pośrednictwem wektorów retrowirusowych. Retrowirusy to grupa wirusów zwierzęcych o charakterystycznym cyklu życiowym, niezwykle przydatnym w terapii genowej. Z łatwością wnikają one do komórek ssaków, kopiują swój jednoniciowy kwas rybonukleinowy (RNA), używając do tego celu własnego enzymu zwanego odwrotną transkryptazą, a powstały dwuniciowy kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA) zostaje następnie wbudowany w przypadkowym miejscu chromosomu komórki gospodarza. Teraz geny wirusa mogą być aktywne tak jak geny komórki i są przekazywane w trakcie podziału tejże komórkom potomnym.

Aby retrowirusy stały się nośnikami genów, trzeba je przerobić, odbierając im patogenny charakter, pozostawiając zaś cechy "wektora". Pozbawia się retrowirusa geny niosące informację o jego własnych białkach i enzymach (z wyjątkiem tych, które regulują aktywność wprowadzanego genu oraz decydują o procesie włączenia go do chromosomów komórek gospodarza), a na to miejsce wbudowuje potrzebny gen. Trzeba też dodać do wektora gen znakujący, tak aby można było śledzić losy wektora razem z dodanym do niego genem głównym. Jako znacznik często wykorzystuje się gen oporności na antybiotyk - neomycynę. Komórki, które pobrały wektor a razem z nim gen oporności na neomycynę, można wybrać i zagęścić w trakcie ich hodowania w obecności tego antybiotyku.
Do początku artykułu...

NIE WYRZUCAĆ KRWI PĘPOWINOWEJ

Na oddziałach położniczych łożysko i pępowina wraz z zawartą w niej krwią są najczęściej niszczone i usuwane. Ostatnie kilka lat przyniosło ogromny wzrost zainteresowania możliwościami wykorzystania krwi pępowinowej. Przedstawione w artykule zastosowanie komórek krwi pępowinowej jest jednym z wielu.

U płodu krwiotworzenie (hematopoeza) zachodzi głównie w wątrobie. W trzecim trymestrze ciąży macierzyste komórki krwiotwórcze przedostają się drogą krążenia z wątroby do szpiku kostnego. W momencie narodzin krew pępowinowa zawiera podobną liczbę komórek macierzystych co szpik kostny dorosłego człowieka. Około drugiego dnia życia noworodka procent obwodowych komórek krwiotwórczych obniża się kilkaset razy, osiągając poziom charakterystyczny dla krwi obwodowej dorosłego człowieka. Krew pępowinowa stanowi więc bezcenne źródło komórek macierzystych. Charakteryzują się one korzystniejszymi często właściwościami niż ich szpikowe odpowiedniki. Ze względu na obniżoną aktywność immunologiczną powodują mniej powikłań po przeszczepieniu u niespokrewnionego biorcy (mniejsze ryzyko odrzucenia i słabiej wyrażona reakcja "przeszczepu przeciwko gospodarzowi"). Łatwiej je także hodować in vitro oraz osiągnąć wyższą wydajność w pobieraniu wektorów wirusowych. Po raz pierwszy krew pępowinową użyto do przeszczepu w 1988 roku.

Na całym świecie powstają banki krwi pępowinowej. W USA w latach 1992-1993 wytypowano dwa ośrodki medyczne, by zbadać realność wykonania tego zabiegu. Ośrodek w Pittsburghu miał ocenić możliwość pobierania i przechowywania krwi do przeszczepów autologicznych, tzn. do wykorzystania jej w przyszłości przez to samo dziecko. Drugi, w Nowym Jorku - pobieranie, typowanie i przechowywanie krwi w celu przeszczepiania krwi pępowinowej obcemu biorcy (przeszczepy allogeniczne).

Obecnie takich banków jest w USA kilkanaście, a każdy przechowuje tysiące wytypowanych pod względem zgodności tkankowej próbek. Jest to szczególnie ważne w kraju tak zróżnicowanym etnicznie jak USA. Na szpik z National Marrow Donor Program (Narodowego Rejestru Dawców Szpiku) czeka się około 6 miesięcy. 80% zarejestrowanych potencjalnych dawców to przedstawiciele rasy białej - kaukaskiej. Banki krwi pępowinowej nie tylko więc mogą skrócić czas oczekiwania na przeszczep, ale także zwiększają szansę jego otrzymania mniejszościom etnicznym.

Banki takie powstają także w wielu miastach Europy. Badania nad wykorzystaniem krwi pępowinowej prowadzone są także w Polsce. Postępy w tej dziedzinie były między innymi przedstawione na posiedzeniu wspólnym Komisji Hematologii Doświadczalnej i Inżynierii Komórkowej PAN oraz Oddziału Warszawskiego Polskiego Towarzystwa Immunologicznego w czerwcu 1995 roku.

Jedyna wątpliwość, którą wyrażają niektórzy badacze dotyczy całkowitej liczby komórek uzyskanych z pępowiny. Może ona okazać się niewystarczająca do zastosowania u dorosłych biorców.
Do początku artykułu...

Dr ELŻBIETA SMOGORZEWSKA pracuje jako immunolog, specjalista cytometrii przepływowej w Research Immunology/BTM-CHLA (Childrens Hospital Los Angeles).

O podobnych zagadnieniach przeczytasz w artykułach:
(06/97) NIEŚMIERTELNE KOMÓRKI KRWI
(06/97) SZPIK JAKO LEK