Twoja wyszukiwarka

MAGDALENA FIKUS
EKSTREMOFILE
Wiedza i Życie nr 12/1996
Artykuł pochodzi z "Wiedzy i Życia" nr 12/1996

Jednym z cudów życia są setki, ba, tysiące reakcji zachodzących stale i jednocześnie w każdej żywej komórce. Co więcej, ku zdumieniu i zazdrości technologów odbywa się to w temperaturze bliskiej otoczeniu i pod atmosferycznym ciśnieniem. Niewiele procesów przemysłowych udaje się prowadzić w takim reżymie.

Poznajmy ekstremofile
Ulubione środowiska ekstremofili
Sztuczka z inteiną
Skąd ta trwałość

Przemysłowa produkcja symbolizowana przez reaktory, piece, kadzie produkcyjne, kojarzy się nam (słusznie) z wysokimi: temperaturą i ciśnieniem, kwaśnym lub zasadowym środowiskiem, stężonymi solami. Do utrzymania takich parametrów na stałym poziomie konieczne są często duże nakłady energii, a same reakcje trzeba jeszcze przyspieszyć, do czego służą różnego typu katalizatory. Komórka, mikroskopijna żywa fabryka, stosuje podobną taktykę i sama wytwarza katalizatory. Najważniejsze z nich to enzymy, które mogą przyspieszyć nawet kilkaset tysięcy razy specyficzną reakcję, a dokonują tego w łagodnych warunkach, optymalnych dla życia komórek.

Nic dziwnego, że pomysł wykorzystania enzymów do przemysłowej katalizy zyskał wielu zwolenników. Jednak niektóre procesy przemysłowe, nawet wspomagane przez enzymy, wymagają wysokiej temperatury i/lub ciśnienia, wysokiego stężenia soli albo kwaśnego odczynu środowiska. Wydawałoby się, że w takich przypadkach trzeba zrezygnować z enzymatycznej katalizy. Czy rzeczywiście?

Wulkan Mutnowski, Kamczatka

Granice zastosowań białek w przemyśle wyznaczane są przez ich trwałość w określonym procesie. Praktyka wskazuje, że enzymy działają najlepiej w podobnych warunkach, w jakich żyje wytwarzający je organizm. Zatem, pomyśleli biotechnolodzy, jeżeli potrzebne są enzymy tolerujące, a nawet preferujące skrajne parametry fizyczne, to może warto sięgnąć do mikroorganizmów zamieszkujących gorące źródła siarkowe, arktyczne morza, wyloty wulkanów czy dno oceanów i zainteresować się ich enzymami.

Badacze takich mikrobów, zwanych żartobliwie ekstremofilami, byli do niedawna uważani za nieszkodliwych dziwaków o ekstremalnych zainteresowaniach; dziś stali się liczną grupą mikrobiologów kokietowanych przez przemysł. Ich praca, poza wymienionymi zastosowaniami praktycznymi, może dostarczyć argumentów w niekończących się dyskusjach o środowisku, w którym niegdyś powstawało ziemskie życie. I tak na przykład niedawno na głębokości 1000 m odkryto w skałach bazaltowych bakterie, które energię do życia czerpią z geochemicznych reakcji.

Te, innym bakteriom utrudniające życie, warunki stanowią swoiste nisze ekologiczne ekstremofilów; dlatego często są one zmuszone zaakceptować więcej niż jedną skrajność: na przykład ulubione środowisko termoacidofilów z gorących źródeł siarkowych jest zarazem kwaśne i gorące, barofile żyją w głębinach oceanów, gdzie panuje ogromne ciśnienie oraz temperatura bliska 0°C.

Ekstremofile zazdrośnie strzegą swoich tajemnic. Nie sposób ich hodować w standardowym laboratorium, bo tam stosuje się warunki, które one odczuwają jako skrajne. Giną więc w temperaturze 37°C lub przy ciśnieniu 1 atmosfery. "Zabawa" z tymi bakteriami wymaga inwestycji w nietypowy sprzęt, a także aparaturę. Redukujące siarkę termofile wytwarzają wiele związków przyspieszających korozję i dlatego nie można ich hodować w klasycznych, metalowych fermentorach. Termoacidofile wytwarzają nierozpuszczalne tlenki metali, które szybko pokrywają szklane naczynia oraz korodują metalowe. Barofile wymagają naczyń odpornych na wysokie ciśnienia.

Wyziewy par siarkowych na wulkanie Mutnowskim, Kamczatka

Jakie cechy i właściwości pozwalają tym organizmom przetrwać w tak niezwykłych środowiskach? Badając szczegółowo te "dziwaki", uczeni stwierdzili, że większość przemian metabolicznych przebiega u nich tak samo, jak w bakteriach "normalnych". Za to struktura zewnętrznych błon wielu ekstremofili odbiega od powszechnie znanej. Chronią one komórki przed zbytnim zasoleniem, kwasem lub zasadami obecnymi w środowisku. Jednak przed wysoką temperaturą lub ciśnieniem nie ma praktycznie ucieczki.

Uczeni zadali więc sobie pytanie, czy ekstremofile nie wytwarzają aby jakichś specjalnych, też ekstremalnych, enzymów. Czy enzym wyodrębniony z bakterii żyjącej w siarkowym gorącym źródle i przeniesiony do probówki w laboratorium lub reaktora w fabryce będzie najlepiej działać w kwasie i przy 100°C?

Gdyby zachodziła więc taka okoliczność - rozmnarzają się biotechnolodzy - to poznając różnice między budową takich enzymów i enzymów "normalnych" moglibyśmy, korzystając z potężnych metod inżynierii genetycznej, przerabiać na zamówienie normalne enzymy na ekstremalne dziwactwa. Dziwactwa użyteczne w różnorodnych procesach biotechnologicznych...

W skład białek wchodzi dwadzieścia kilka rodzajów aminokwasów. Przeciętne białko składa się z kilkuset aminokwasów połączonych ze sobą w łańcuch. O cechach białka, jego strukturze, aktywności, decyduje kolejność ułożenia aminokwasów.

Co dzieje się z białkami po ich podgrzaniu, wie każdy amator jajek na twardo. Białka pochodzące z konwencjonalnych organizmów już w temperaturze bliskiej 60°C tracą szybko i zazwyczaj nieodwracalnie strukturę oraz aktywność. Powyżej 80°C następują także zmiany chemiczne, polegające na skracaniu łańcucha.

Niewiele wiemy o mikroorganizmach żyjących w skrajnych warunkach, jeszcze mniej o ich enzymach. Słynny wyjątek to stosowane w metodzie PCR termostabilne polimerazy DNA, zachowujące aktywność przez kilkadziesiąt cykli obejmujących podgrzewanie do 95°C. (Patrz: m.in. "WiŻ", nr 12/1995).

Solniska na wyspie Lanzarote, Wyspy Kanaryjskie

Wszystkie enzymy, które udało się wydzielić z termofilnych bakterii są trwałe nawet w temperaturze powyżej 100°C. Ale najciekawsze wyniki przyniosło doświadczenie, w którym gen pochodzący z termofilnych bakterii Pyrococcus furiosus kodujący białko zwane ferrodoksyną, wprowadzono do "najzwyklejszej" pod względem wymagań środowiskowych mezofilnej bakterii Escherichia coli. Tak zmienione komórki E. coli wytwarzały ferrodoksynę odporną na wysoką temperaturę. Cecha termostabilności zapisana jest więc w genie, a zatem jej ujawnienie nie wymaga żadnych dodatkowych czynników ani szczególnych warunków otoczenia.

Do niedawna znano struktury tylko dwóch białek pełniących te same funkcje a uzyskanych z bakterii termofilnych i "normalnych". Nie widać między nimi żadnych istotnych różnic, poza specjalnym zwinięciem łańcucha białka termofilów, które umożliwia maksymalne schowanie atomów we wnętrzu cząsteczki. Ogranicza to ich oddziaływanie ze środowiskiem zewnętrznym.

Niestety, nie znamy jeszcze prostej odpowiedzi na pytanie, dlaczego enzymy ekstremofilne są o tyle trwalsze od "normalnych", nie umiemy ustalić ogólnych reguł rządzących termostabilnością termoenzymów. Cecha ta stanowi indywidualną własność białka i wynika z unikatowej kombinacji różnych mechanizmów. Nie możemy więc liczyć na szybkie opracowanie procedur przekształcania "konwencjonalnego" białka w termostabilne.

Są jednak szanse na uzyskiwanie ekstremoenzymów w inny sposób. Do ich produkcji można bowiem zaprząc normalne bakterie wzbogacone metodami inżynierii genetycznej o potrzebny gen. W ten sposób będzie się też zapewne szukać trwalszych form enzymów już stosowanych w biotechnologii - by móc je następnie użyć w skrajnych warunkach technologicznych. Na takie enzymy czeka przemył papierniczy, chemiczny (środki czystości), przetwórczy (żywność). Wśród bakterii ekstremofilnych znajdą się zapewne takie, które mają enzymy zachowujące aktywność w niewodnych rozpuszczalnikach. Ekstremofile oraz ich enzymy znajdą też zastosowanie w wysoko wydajnych systemach zużywania odpadów, oczyszczania i odsalania wód. Wreszcie tylko patrzeć, jak zobaczymy je w hollywoodzkich horrorach...

POZNAJMY EKSTREMOFILE

Barofile: mikroorganizmy rosnące przy wysokim ciśnieniu;
Psychrofile: mikroorganizmy rosnące w temperaturze bliskiej 0°C;
Termofile: mikroorganizmy rosnące w wysokiej temperaturze;
Acidofile: mikroorganizmy rosnące w kwaśnym środowisku;
Halofile: mikroorganizmy rosnące w wysoce zasolonych środowiskach.

Do początku strony

ULUBIONE ŚRODOWISKA EKSTREMOFILI

Istotny
Skrajność Przykład Habitat parametr
organizmu wzrostu
Wysokie Pyrococcus Geotermiczne
temperatury furiosus osady dna 100oC
morskiego
Niskie Bacillus TA41 Ocean 4oC
temperatury Antarktyczny
Wysokie Methanococcus Głębokie, 250 atm
ciśnienie janashii gorące źródła 85oC
oceaniczne
Wysokie pH Clostridium Ścieki pH 10.1
paradoxum
Niskie pH Metallosphaera Wody pH 2.0
sedula kopalniane
Wysokie Halobacterium Słone wody 30% NaCl
zasolenie halobium

Do początku strony

SZTUCZKA Z INTEINĄ

Termokoki, przedstawiciele królestwa Archaea, najstarszych ewolucyjnie mikroorganizmów, sprawiły uczonym nie lada niespodziankę. Okazało się, że pod wpływem wysokiej temperatury z syntetyzowanego w termokokach białka wycinany jest spontanicznie centralny jego fragment, nazwany inteiną, i chemicznie zespalane dwa fragmenty boczne. Zjawisko to można wykorzystać w praktyce, na przykład do produkcji białek toksycznych dla komórki. W tym celu do środka genu śmiercionośnego białka należy włączyć gen, który koduje fragment odpowiadający inteinie.

Taki chimeryczny gen wprowadzony metodami inżynierii genetycznej do zwykłych bakterii "zaowocuje" chimerycznym białkiem z centralnie położonym fragmentem inteiny (w tej formie nietoksycznym). Po jego wyodrębnieniu z bakterii wystarczy podnieść temperaturę i inteina sama się wytnie, a połączone zewnętrzne fragmenty utworzą potrzebną nam truciznę.

Do początku strony

SKĄD TA TRWAŁOŚĆ?

Wiadomo, że budowa chemiczna i przestrzenna enzymów pochodzących z bakterii termofilnych i mezofilnych są bardzo podobne, a sposób działania analogiczny. Termoenzym wytworzony metodami inżynierii genetycznej w zwykłej bakterii zachowuje stabilność termiczną. Jego cechy muszą być zatem zakodowane w budowie samej cząsteczki, a nie w innych cechach wytwarzającego go organizmu.

Z badań fizycznych termoenzymów wynika, że różnica w swobodnej energii stabilizacji między nimi a enzymami "tradycyjnymi" jest niewielka, rzędu 5-15 kcal/mol, co oznacza, iż różnice chemiczne dotyczą tylko niewielkiej liczby wiązań (wodorowych, hydrofobowych, mostków solnych).

Ostatnio porównano struktury krystaliczne jedenastu analogicznie działających par enzym-termoenzym. Okazało się, że ten ostatni ma bardziej "sztywną" strukturę przestrzenną, bardziej "upakowaną" wokół hydrofobowego rdzenia (hydrofobowy - stroniący od wody, a więc kryjący się wewnątrz cząsteczki białka). Każda wolna przestrzeń wewnątrz cząsteczki białka jest u termoenzymów wypełniona hydrofobowymi resztkami aminokwasów: w zwykłych enzymach miejsca te zajmują często cząsteczki wody. Ochrona jednej grupy hydrofobowej przed oddziaływaniem z wodą zwiększa energię stabilizacji całej cząsteczki o około 1.3 kcal/mol. Sumaryczny skutek kilku podobnych zmian powoduje, że na przykład objętość wszystkich wolnych wewnętrznych przestrzeni w termoenzymie syntazie cytrynianowej odpowiada 30% takich objętości analogicznego enzymu wydzielonego z komórek świni.

Istotną rolę w stabilizacji termoenzymów odgrywają także tzw. mostki solne. Ich zlikwidowanie (w wyniku pewnych zabiegów chemicznych) w termostabilnej alfa-amylazie praktycznie znosi całą jej odporność na temperaturę.

Niewielkie zmiany w składzie i kolejności pojedynczych aminokwasów mogą zmieniać naprężenia strukturalne całej cząsteczki enzymu, a także ułatwiać tworzenie się dłuższych odcinków o stabilnej strukturze przestrzennej (np. helis alfa), z jednoczesnym skracaniem odcinków nieuporządkowanych (tzw. pętli), od których rozpoczyna się destabilizacja termiczna całego enzymu. Zjawisko to można było jednoznacznie wykazać metodami inżynierii genetycznej.

Utrata aktywności katalitycznej przez zwykłe enzymy wiąże się zazwyczaj z rozpadem wszystkich typów struktur przestrzennych danej cząsteczki białka, po czym nastepuje jego wytrącanie. W przypadku termoenzymów szybciej od zniszczenia struktury dochodzi do nieodwracalnych zmian w budowie chemicznej. Następuje bowiem pękanie łańcucha peptydowego, uwalnianie grup funkcyjnych itp.

Do początku strony

Fot. A. W. Bilińscy