Twoja wyszukiwarka

MAGDALENA FIKUS
NASZ CZTERDZESTY SIÓDMY
Wiedza i Życie nr 6/1997
Artykuł pochodzi z "Wiedzy i Życia" nr 6/1997

NATURA WYPOSAŻYŁA NASZ GATUNEK W 46 CHROMOSOMÓW, ZAŚ AMERYKAŃSCY BIOLODZY SKONSTRUOWALI CZTERDZIESTY SIÓDMY.

W 1983 roku Andrew Murrayi Jack Szostak z Massachusetts General Hospital w Bostonie skonstruowali pierwszy na świecie sztuczny chromosom drożdżowy, YAC (Yeast Artificial Chromosome).

W komórce drożdży Saccharomyces cerevisiae (16 własnych chromosomów) YAC zachowywał się tak, jakby zawsze do drożdży należał. Można mu było też dodać różne geny, które stawały się wtedy jego integralną częścią, razem z nim powielając się i przenosząc do potomnych komórek. Elementami niezbędnymi do istnienia YAC są: sekwencje nukleotydów, od których rozpoczyna się replikacja (powielenie) DNA, telomery oraz centromer.

Chromosom wygląda pod mikroskopem jak przewężona kiełbaska. Jego centralnym składnikiem i oczywiście właściwym nośnikiem informacji genetycznej jest pojedyncza cząsteczka DNA. Ile chromosomów w komórce, tyle też różnych cząsteczek DNA. DNA w chromosomie jest w swoisty sposób upakowany, tworząc kompleksy z białkami. W chromosomie odpowiednio wybarwionym i oglądanym pod mikroskopem wyróżnić można przewężenie, położone zazwyczaj blisko środka długości chromosomu. Temu przewężeniu odpowiada określona sekwencja nukleotydów w DNA zwana centromerem.

Z centromerem wiążą się włókna wrzeciona podziałowego w czasie dzielenia się komórki. One to odciągają podwojone chromosomy do dwu biegunów starej komórki, aby po jej podziale znalazły się w dwu potomnych jądrach dwu nowych komórek. Inaczej mówiąc, od centromerów zależy przemieszczanie chromosomów w czasie podziału komórki. Drożdżowe centromery liczą sobie około kilkuset nukleotydów.

Zdjęcie z elektronowego mikroskopu kilku ludzkich chromosomów (barwy umowne)

Prawdopodobnie sekwencja nukleotydów, wyznaczająca początki replikacji, jest swoista dla każdego gatunku. W każdym chromosomie znajduje się wiele z nich, oddzielonych od siebie kilkoma tysiącami nukleotydów. Powielanie jednej długiej cząsteczki DNA każdego chromosomu rozpoczyna się jednocześnie od wielu początków replikacji rozmieszczonych wzdłuż cząsteczki. Drożdżowe początki replikacji zwane ARS mają około 200 nukleotydów.

Telomery, (patrz: Skazani na starość, "WiŻ" nr 5/1997) to sekwencje nukleotydów położone na końcach cząsteczek DNA w poszczególnych chromosomach. W drożdżach jest to osiem nukleotydów o znanej sekwencji, powtórzonej kilkadziesiąt razy. Ich rola polega przede wszystkim na chronieniu chromosomów przed szkodliwymi procesami destrukcji DNA od końców cząsteczki. Telomery sprawiają także, iż chromosomy po każdym podwojeniu nie ulegają skróceniu, które ze względu na molekularny mechanizm procesu powielania DNA mogłoby się zdarzyć w trakcie tego wielce złożonego procesu. Odkrycie enzymu o dźwięcznej nazwie telomeraza, dodającego telomery do końców DNA, pozwoliło na snucie przypuszczeń o istotnej roli enzymu, i samych telomerów u człowieka oraz zwierząt w transformacji zdrowej komórki w komórkę nowotworową.

Aby chromosom był trwały, musi także przekroczyć przynajmniej pewną krytyczną długość, w przypadku drożdży sądzi się, że jest to około 230 000 nukleotydów, ponieważ tyle mierzy najkrótszy z naturalnych ich chromosomów. Konstruując YAC, a konstrukcja - przypominam - odbywała się in vitro, poza komórką, spełniono ten ostatni warunek przez dodanie dodatkowych genów do wymienionych już elementów. Jeżeli w ten sposób wprowadzimy je, wraz z YAC, na stałe do komórek drożdżowych, zmienimy ich dziedzictwo.

Jednakże swoją popularność w ostatnich latach sztuczne chromosomy drożdżowe zawdzięczają temu, że to w nich inżynierowie genetyczni przechowują duże fragmenty DNA pochodzące z organizmów, których genomy postanowiono w pełni zbadać i scharakteryzować: np. myszy, muszki owocowej i - co interesuje nas najbardziej - człowieka. Istnieją również myszy transgeniczne (patrz: Mysz w laboratorium, "WiŻ" nr 10/1995), które urodziły się jako nosicielki YAC. Współcześni konstruktorzy YAC potrafią dodać do sztucznego chromosomu do dwu milionów nukleotydów pochodzących z DNA innego gatunku niż drożdże.

Obraz uzyskany w mikroskopie elektronowym; ostatnia faza podziału komórki człowieka. Czerwonym kolorem zabarwiono chromosomy

Pożegnajmy się na chwilę z drożdżami i ich YAC. Spójrzmy na komórki człowieka. Każda komórka ludzkiego ciała, z wyjątkiem komórek rozrodczych, ma po 23 pary chromosomów, w każdej parze jeden pochodzi od ojca, drugi od matki. Zapis informacji genetycznej odczytywany jest "porcjami", z odcinków cząsteczki DNA stanowiących geny. W pewnym uproszczeniu można powiedzieć, że jeden gen to zapis informacji sterującej syntezą i decydującej o budowie chemicznej jednego białka. Jeżeli w komórce rozrodczej człowieka jakiś gen uległ uszkodzeniu, czego skutkiem staje się zmiana w strukturze tego białka, to końcowym objawem u potomka tego człowieka może być jedna z kilku tysięcy chorób zwanych genetycznymi, dziedziczona następnie z pokolenia na pokolenie.

Odkąd poznaliśmy dobrze budowę DNA, zrozumieliśmy podstawy i jego przemian, i genetycznej trwałości, zaczęliśmy myśleć o terapii genowej, czyli naprawianiu uszkodzeń w genach: bądź przez wymianę uszkodzonego genu na prawidłowy, bądź dodanie komórce genu prawidłowego. O terapiach genowych dyskutuje się od dwudziestu lat, od kilku - wykonuje się różnego typu próby. Jak na razie bez ostatecznego powodzenia: są to procedury niezwykle trudne i delikatne, budzące opory w wielu środowiskach; wszak chodzi jedynie o wstępne doświadczenia, które trzeba prowadzić na ludziach, a nie rutynowe zabiegi terapeutyczne.

Zestaw barwionych chromosomów człowieka (mężczyzna). Ostatnia para chromosomów (lewy dolny róg) to dwa chromosomy płciowe, Y i X.

Jednym z najważniejszych problemów wymagających nowych rozwiązań jest sposób wprowadzania prawidłowego genu do komórek. Wszystkie wypróbowywane dotychczas metody są zawodne i niepowtarzalne, a więc niedoskonałe.

I oto przyszła uczonym do głowy myśl, aby wyposażać "chore" komórki w dodatkowy sztuczny chromosom, podobnie jak drożdżom dodaje się YAC. Sztuczny ludzki chromosom, HAC (Human Artificial Chromosome), mógłby wnosić do takiej komórki naprawiony gen. Jak go jednak utworzyć, aby stał się naszym czterdziestym siódmym chromosomem? Nie od mamy, nie od taty, ale od genetycznego chirurga?

Umiejętności, które zdobyli uczeni konstruując YAC miały przyspieszyć proces tworzenia sztucznego chromosomu człowieka. Jednak duże rozmiary naturalnych ludzkich chromosomów i cząsteczek DNA (nawet najmniejszy ludzki chromosom jest znacznie większy od największego chromosomu drożdży), jak również brak wyczerpującej wiedzy o ich chemicznej budowie, okazały się hamulcem szybkiego postępu w tej dziedzinie.

Wcześnie, bo w 1988 roku znaleziono ludzkie telomery. Okazało się, że mają niewiarygodnie prostą budowę: jest to tylko sześć nukleotydów, blok powtórzony wieleset razy na końcach cząsteczki DNA wchodzącej w skład chromosomu. Więcej kłopotów sprawiło konstruktorom ludzkiego chromosomu znalezienie sekwencji, od których rozpoczyna się podwajanie cząsteczki DNA, ale i te w końcu udało się wyszukać.

Budujemy sztuczny chromosom

O ile ludzkie telomery i sekwencje rozpoczynające replikację okazały się prostsze i łatwiejsze do znalezienia niż przypuszczano, o tyle centromery stały się prawdziwą zmorą konstruktorów HAC. Już stosunkowo wcześnie odkryto, że mogą one liczyć nawet kilka milionów nukleotydów. Jednak nikomu nie udało się wydzielić takich fragmentów ludzkich chromosomów, które w sztucznie (poza komórką) konstruowanym potencjalnym HAC mogłyby pełnić funkcję prawdziwego centromeru. Być może jakiś niezbędny fragment ludzkiego centromeru znajduje się poza granicami przewężenia chromosomu. A może fragmenty DNA, odpowiadające centromerowym sekwencjom, są zbyt złożone, aby mogły być łączone w całości z innymi cząsteczkami DNA i tworzyć w komórce prawidłowe kompleksy z prawidłowymi towarzyszącymi centromerom białkami.

Jeżeli to ostatnie przypuszczenie jest prawdziwe, składanie sztucznego chromosomu poza komórką z izolowanych fragmentów DNA nie może się udać. Wymyślono zatem inne podejścia do konstrukcji sztucznego ludzkiego chromosomu. Wykorzystano zjawisko "odrąbywania" końców naturalnych chromosomów przez wprowadzone z zewnętrz do komórki w dużej liczbie sekwencje telomerowe. Na razie w doświadczeniach in vitro udało się w ten sposób skrócić ludzki chromosom płciowy Y z 50 do 6 milionów nukleotydów. Mimo iż tak krótki, wciąż jeszcze przypomina swoim zachowaniem chromosom. Do manipulacji genetycznych poza komórką, do pełnienia funkcji nośnika wybranych genów, jest on jednak nadal zbyt długi.

Inny sposób postępowania, który zakończył się opisanym w marcu br. przez codzienną prasę sukcesem, wybrała grupa naukowców, którą kieruje prof. Huntington F. Willard z Case Western Reserve University i firmy Athersys Inc. (Cleveland, Ohio, USA). Mam wrażenie, że trochę za wcześnie zabrzmiały fanfary, ponieważ konstrukcja z Ohio utworzyła się dość chyba przypadkowo i doświadczenie to nie może być w pełni powtarzalne.

Jedynie około 5% DNA człowieka to geny kodujące białka, resztę stanowią sekwencje nukleotydów w większości nieznanej funkcji - dlatego nazwano je nieelegancko "junk-DNA", co w wolnym przekładzie można by określić jako "DNA ze śmietnika" (oczywiście, molekularnego). Choć ich rola nie została wyjaśniona, to mało kto ośmiela się przypuszczać, że są komórce do niczego nieprzydatne.

Badacze z Cleveland uważają, że podstawą ich sukcesu jest zastosowanie pewnej frakcji "DNA ze śmietnika", którą nazwano niegdyś satelitarnym DNA typu alfa. Są to wielokrotnie powtarzające się bloki sekwencji od kilku do kilkudziesięciu nukleotydów, często znajdowane w pobliżu środka cząsteczek DNA. Czemu służą - nie wiadomo.

Połączono alfa satelitarny DNA w długie ciągi bloków i wprowadzono do komórek ludzkiej linii nowotworowej. Linie komórek hodowane poza organizmem, w warunkach sztucznych, o pewnych cechach przypominających komórki nowotworowe, uważa się za nieśmiertelne. W odróżnieniu od komórek normalnych, które w hodowli mogą podzielić się tylko 50 razy, a potem hodowla zamiera, te nowotworowe mogą się dzielić w nieskończoność.

Do tych samych komórek wprowadzono jednocześnie telomerowy DNA i odcinki, od których rozpoczyna się powielanie DNA. Wszystkie te fragmenty połączyły się ze sobą, tworząc optycznie wyróżnialne strukturalne twory ochrzczone mianem mikrochromosomów, o długości od 6 do 10 milionów nukleotydów. Prawdopodobnie są one zdolne do replikacji, ponieważ utrzymały się jako niezależne chromosomy przez 6 miesięcy od mo-
mentu "wpuszczenia" nowego DNA do komórek. Utworzone w wyniku przypadkowego łączenia się ze sobą różnych funkcjonalnie fragmentów ludzkiego DNA. Mikrochromosomy przechowuje się w Cleveland, w hodowlanych liniach komórkowych.

Sądzę, że trudno uznać te mikrochromosomy za całkowicie dojrzały do dalszych prac sztuczny chromosom człowieka. Powstał wewnątrz komórek nowotworowych, w wyniku całkowicie nie kontrolowanych przez eksperymentatorów procesów. Od takiego przypadkowego tworu, do "zdrowego", funkcjonalnego, czterdziestego siódmego chromosomu jest chyba jeszcze bardzo daleko. Ale ostatnia konstrukcja sztucznego ludzkiego chromosomu dowodzi, że i na śmietniku można znaleźć prawdziwe skarby molekularne....

Prof. dr hab. Magdalena Fikus pracuje w Instytucie Biochemii i Biofizyki PAN w Warszawie.

O podobnych zagadnieniach przeczytasz w artykułach:
(10/97) ZBZIKOWANY ARCHITEKT
(05/97) SKAZANI NA STAROŚĆ