Twoja wyszukiwarka

TOMASZ ŁĘSKI
GENETYCZNI KOLONIZATORZY
Wiedza i Życie nr 9/1997
Artykuł pochodzi z "Wiedzy i Życia" nr 9/1997

MIKROORGANIZMY WYWOŁUJĄCE CHOROBĘ NISZCZĄCĄ UPRAWY SŁUŻĄ DZIŚ CZŁOWIEKOWI DO PRODUKCJI ULEPSZONYCH GENETYCZNIE ROŚLIN.

Drobnoustroje z rodzaju Agrobacterium do perfekcji opanowały sztukę "kolonizacji genetycznej" - wprowadzania własnych genów do komórek roślinnych. Odkrycie tego unikalnego w przyrodzie mechanizmu stało się podstawą rozwoju inżynierii genetycznej roślin. Od kilkunastu lat biolodzy korzystają z usług Agrobacterium do badań nad genetyką roślin, a również po to, by produkować co roku setki ich nowych odmian. Opanowanie techniki wykorzystującej bakterie z rodzaju Agrobacterium do umieszczania obcych genów w roślinach było początkiem rewolucji, której owoce w postaci ulepszonych płodów rolnych już teraz trafiają na nasze stoły. Z pewnością wiele roślin transgenicznych znajdzie niebawem swoje zastosowanie w różnych gałęziach przemysłu, chociażby do taniej produkcji szczepionek.

Choroba zwana guzowatością szyjki korzeniowej, lub inaczej rakiem szyjki korzeniowej, znana jest hodowcom i rolnikom już od ponad stu lat. U zaatakowanych roślin, najczęściej na granicy pomiędzy łodygą a korzeniem, zaczynają pojawiać się guzowate narośla, w skrajnych przypadkach osiągające do pół metra średnicy. Ofiarą tej choroby padają rośliny należące do około 140 rodzajów w 60 różnych rodzinach. Jest ona przyczyną sporych strat szczególnie w uprawach winorośli i wielu innych krzewów i drzew owocowych. Choroba ta atakuje także liczne gatunki roślin ozdobnych. Z tych powodów na początku naszego wieku zaczęli interesować się nią naukowcy. Dokładnie 90 lat temu Erwin Smith oraz C. Townesend opublikowali na łamach tygodnika "Science" artykuł, w którym wyjaśniali przyczyny guzowatości szyjki korzeniowej. Donieśli oni, że wywołują ją pewne bakterie, żyjące w glebie. Dzisiaj wiadomo, że należą one do rodzaju Agrobacterium. Najlepiej znany jest gatunek Agrobacterium tumefaciens. Choć odkryto jeszcze kilka innych niebezpiecznych dla roślin gatunków Agrobacterium, na przykład atakujące winną latorośl Agrobacterium vitis czy Agrobacterium rhizogenes wywołujące chorobę roślin polegającą na wyrastaniu w miejscu infekcji wiązki korzeni włosowatych.

Pomidory były pierwszymi roślinami transgenicznymi, które pojawiły się w amerykańskich sklepach. Wyprodukowano je (właśnie) z wykorzystaniem Agrobacterium. Od "tradycyjnych" różniły się jedynie przedłużoną trwałością

Dalsze badania, które między innymi prowadził polski uczony J. Czosnowski, doprowadziły do odkrycia niezwykłych właściwości tkanki narośli wywołanych przez Agrobacterium. Otóż komórki z nich pobrane, nawet po całkowitym oczyszczeniu z bakterii, nadal potrafiły dzielić się szybko i bez żadnych ograniczeń. Co bardziej zaskakujące, do wzrostu i podziałów komórki te, w przeciwieństwie do wszystkich innych, nie wymagały obecności w pożywce żadnych hormonów roślinnych. Wykazywały więc wszystkie cechy komórek nowotworowych znanych wcześniej u zwierząt.

Przez wiele lat szukano odpowiedzi na pytanie, w jaki sposób bakterie potrafią przekształcić zdrowe komórki w dzielące się w sposób nie kontrolowany komórki narośli? Zanim jednak udało się to wyjaśnić, w latach sześćdziesiątych grupa francuskich badaczy pod kierunkiem Georgesa Morela z Institut National de la Recherche Agronomique w Wersalu odkryła kolejną nieoczekiwaną właściwość tych komórek. Okazało się, że produkują one w dużych ilościach pewne rzadko spotykane w przyrodzie, drobnocząsteczkowe związki organiczne. Związki te, nazwane opinami, to pochodne metabolitów powszechnie występujących w komórkach roślinnych. Najczęściej syntetyzowane są one z aminokwasów (głównie argininy, jak na przykład oktopina lub nopalina). Opiny są dla komórek roślinnych zupełnie bezużyteczne. Stanowią natomiast pożywienie bakterii kolonizujących zaatakowaną tkankę. Oznaczało to, że Agrobacterium potrafi nie tylko wywoływać nieodwracalną przemianę nowotworową (transformację) komórek roślinnych, ale też zmusić je do produkcji pokarmu dla bakterii.

Na wyjaśnienie mechanizmów leżących u podstaw choroby wywoływanej przez Agrobacterium pozwolił dopiero przełom w biologii dokonany w połowie naszego wieku. Dzięki nowoczesnym technikom biologii molekularnej udało się odkryć zasady jedynej w swoim rodzaju zależności pomiędzy bakteriami a komórkami roślinnymi. Miliony lat ewolucji pozwoliły bakteriom na wypracowanie czegoś, co naukowcy określają dziś jako "kolonizację genetyczną" komórek roślinnych.

Jednym z punktów zwrotnych w analizie mechanizmów tejże kolonizacji genetycznej było odkrycie, że nie wszystkie szczepy Agrobacterium tumefaciens wywołują chorobę. Porównanie szczepów dokonane w roku 1974 przez Jeffa Schella i Marca Van Montagu wraz ze współpracownikami, potwierdziło wcześniej wysuwane hipotezy, że patogenność zależy od obecności lub braku w komórce dodatkowej cząsteczki kwasu deoksyrybonukleinowego, zwanego plazmidowym DNA.

Winorośl zaatakowana przez Agrobacterium zaczyna chorować na raka szyjki korzeniowej, objawiającego się guzowatymi naroślami tworzącymi się u nasady łodygi (zdjęcie dolne)

Fot. Internet

W komórkach bakterii poza główną cząsteczką DNA zawierającą informację genetyczną niezbędną do funkcjonowania komórki (genofor, czyli "chromosom" bakteryjny) występują też pewne dodatkowe cząstki DNA. Cząsteczki takie, zwane plazmidami, są powszechnie obecne w komórkach bakterii różnych gatunków. Najczęściej znajdują się na nich geny, które nie są niezbędne drobnoustrojowi do przeżycia, ale dają mu korzyść w pewnych określonych warunkach. Na przykład geny nadające oporność na antybiotyki najczęściej zlokalizowane są właśnie w plazmidach. Bakterie ponoszą pewien "koszt" związany z utrzymywaniem plazmidu w komórce, ale dzięki niemu mogą przetrwać w warunkach, w których bakteria bez plazmidu zginie (na przykład w obecności antybiotyku). Plazmidy znajdowane w Agrobacterium składają się z około 200 tys. nukleotydów, są zatem stosunkowo duże.

Wprowadzenie plazmidu z wirulentnego (mogącego wywoływać chorobę) szczepu Agrobacterium tumefaciens do szczepu nie wykazującego wirulencji sprawiało, że ten ostatni nabierał zdolności do wywoływania guzowatości szyjki korzeniowej. To właśnie plazmid niesie geny odpowiedzialne za kolonizację genetyczną niezbędną do wywołania choroby. W roku 1974 zespół naukowców z University of Washington w Seattle (Eugene Nester, Milton Gordon, Mary Chilton i współpracownicy) znalazł fragmenty bakteryjnego plazmidu w chromosomach komórek roślinnych wyizolowanych z chorych roślin. W zdrowych komórkach takiego fragmentu DNA nie zdołano wykryć. Wszystko wskazywało na to, że fragment DNA z plazmidu Agrobacterium przenoszony jest do atakowanych komórek. To odkrycie było ogromnym zaskoczeniem dla naukowców. Nikt wcześniej nie przypuszczał, że istnieją w przyrodzie mechanizmy umożliwiające przekazywanie informacji genetycznej pomiędzy komórkami organizmów tak ewolucyjnie odległych, należących do różnych królestw. Przed biologami stanęło zadanie rozwiązania fascynującej zagadki, w jaki sposób bakterie umieszczają fragment swego DNA w komórce roślinnej i jak to się dzieje, że bakteryjne geny działają w tak odmiennym otoczeniu.

Już od wielu lat biolodzy molekularni starali się opanować umiejętność umieszczania obcych fragmentów DNA w komórkach roślinnych w celu uzyskania precyzyjnie zmodyfikowanych genetycznie roślin. Okazało się, że miliony lat wcześniej bakterie zdołały opanować tę sztukę.

Fot. Internet

Obecnie znamy dość dokładnie strukturę plazmidów niesionych przez chorobotwórcze szczepy Agrobacterium. DNA, który w wyniku ataku na komórkę roślinną zostaje umieszczony w tejże komórce (tzw. T-DNA), niesie pakiet genów niezbędnych do przejęcia nad nią częściowej kontroli. W skład tego pakietu wchodzą geny odpowiedzialne za produkcję enzymów syntetyzujących hormony roślinne. Komórka, produkując je, pobudza samą siebie i okoliczne komórki do podziałów, co prowadzi do lokalnego nie kontrolowanego wzrostu tkanki objawiającego się powstaniem narośli. Inne geny dostarczone na podrzuconym DNA niosą informację na temat budowy drugiej grupy enzymów, których zadaniem jest produkcja opin. Dzięki takiej kombinacji genów powstaje guz złożony z komórek roślinnych produkujących opiny będące pokarmem dla bakterii. Agrobacterium kolonizujące taki guz znajduje się w luksusowej sytuacji bezpieczeństwa oraz obfitości składników pokarmowych.

Z określonego typu opin potrafi korzystać jedynie szczep, który zmusił komórki roślinne do ich produkcji. A więc wyłącznie szczepy, które sprawiają, że roślina zaczyna produkować agropinę, mogą z niej korzystać; podobnie wyłącznie szczepy wywołujące produkcję oktopiny mogą z niej i tylko z niej korzystać. Wyjaśnienie tego zjawiska okazało się bardzo proste. Bakterie, które umieszczają w komórkach rośliny geny umożliwiające produkcję konkretnej opiny, dysponują też genami pozwalającymi je wykorzystywać, nie mają jednak możliwości posilania się innymi rodzajami opin.

Schemat kolonizacji genetycznej. 1. Zraniona roślina wydziela substancje pobudzające Agrobacterium; 2. Z plazmidu Agrobacterium wycinany jest jednoniciowy fragment DNA (tak zwany T-DNA); 3. T-DNA otaczany jest specjalnymi białkami chroniącymi go podczas transportu; 4. W błonie komórkowej bakterii wytwarzany jest specjalny kanał kontaktujący się z komórką roślinną. Kanałem tym opakowany białkami T-DNA przerzucany jest do komórki roślinnej; 5. Dzięki temu, że opakowujące T-DNA białka zawierają w swej strukturze zakodowany adres, pod który należy je dostarczyć, T-DNA w komórce roślinnej kierowany jest do jądra; 6. Tam włącza się do materiału genetycznego komórki i uruchamia produkcję opin oraz hormonów roślinnych (na zdjęciu: korzenie drzewka owocowego zaatakowanego przez Agrobacterium)

Wg "Trends in Biotechnology"

Najbardziej frapujący był jednak problem, w jaki sposób cząsteczka DNA trafia z komórki bakteryjnej do roślinnej. Dzięki badaniom wielu grup naukowców na całym świecie udało się poznać szczegółowo mechanizm tego zjawiska (ryc. obok). Wiele wskazuje na to, że przekazywanie DNA pomiędzy komórką bakteryjną a roślinną jest bardzo podobne do procesu koniugacji, w którym bakterie mogą przekazywać między sobą całe plazmidy lub ich fragmenty.

Powszechnie wiadomo, że geny bakteryjne w znacznym stopniu różnią się od genów roślinnych. Szczególnie te ich fragmenty, które odpowiadają za regulację funkcjonowania genów, mają inną organizację. Tymczasem geny z T-DNA Agrobacterium działają doskonale w komórkach roślin. Okazało się jednak, że mają one architekturę genów roślinnych, a więc są zaprojektowane specjalnie w celu wysłania do komórki roślinnej. Niektórzy specjaliści twierdzą, że geny te pierwotnie należały do roślin i przed wieloma milionami lat zostały skradzione przez Agrobacterium, które przystosowało je do swoich celów.

Podczas badań nad Agrobacterium odkryto również, że komórka bakteryjna jest w stanie odbierać od rośliny pewne sygnały, które umożliwiają atak w miejscu jej zranienia. Tam właśnie produkowane są spore ilości drobnocząsteczkowych substancji, będących półproduktami do syntezy ściany komórkowej. Agrobacterium wykrywa te związki (na przykład acetosyringon czy a-hydroksyacetosyringon). Bakterie gromadzą się wokół zranienia i przypuszczają atak na roślinę. Z tej przyczyny infekcje Agrobacterium stały się częstsze i łatwiej zauważalne po zmechanizowaniu technik uprawy roślin, które często prowadzą do lokalnych uszkodzeń tkanki rośliny.

Agrobacterium jest rutynowo wykorzystywane do produkcji roślin transgenicznych

Fot. Marek Chromicki

Gdy tylko odkryto opisane wyżej mechanizmy "kolonizacji genetycznej", jasne było, że biolodzy będą chcieli wykorzystać je do produkcji zmodyfikowanych genetycznie roślin. Pomysł był prosty: należało wstawić do plazmidu Agrobacterium odpowiedni gen i pozwolić bakterii wysłać go do komórek roślinnych, z których można by następnie wyhodować całą zmodyfikowaną genetycznie roślinę. Poważnym mankamentem takiej techniki był fakt, że w ten sposób uzyskiwano wyłącznie komórki roślinne o charakterze nowotworowym. Z takich komórek niemal niemożliwe jest odtworzenie zdrowej rośliny.

Dopiero usunięcie z T-DNA genów wywołujących transformację nowotworową dało naukowcom oczekiwane "narzędzia" - tzw. plazmidy rozbrojone, dzięki którym udało się skonstruować już wiele nowych odmian roślin.

Obecnie Agrobacterium jest rutynowo wykorzystywane w celu otrzymywania roślin zwanych transgenicznymi zawierających dodatkowe geny często pochodzące z innych gatunków. Są to między innymi odporne na choroby wersje roślin uprawnych (na przykład ziemniak odporny na wirusa liściozwoju), rośliny, których owoce dłużej zachowują świeżość i tym podobne. Niestety, nie wszystkie gatunki roślin można modyfikować genetycznie, korzystając z Agrobacterium. Bakterie te nie atakują na przykład większości roślin jednoliściennych (a więc na przykład zbóż). Dla tej grupy roślin opracowuje się inne metody umieszczania fragmentów DNA w ich komórkach.

Systemy inżynierii genetycznej oparte na Agrobacterium są jednak wciąż niezastąpione. Lekcja, której udzieliły naukowcom te bakterie, uświadomiła nam, jak różnorodne i niezwykle wyrafinowane mogą być strategie przeżycia tych niepozornych organizmów. Z pewnością inżynieria genetyczna roślin nie jest ostatnią rzeczą, której się od bakterii nauczyliśmy.

Mgr TOMASZ ŁĘSKI pracuje w Zakładzie Mikrobiologii Molekularnej Centralnego Laboratorium Surowic i Szczepionek w Warszawie.

O podobnych zagadnieniach przeczytasz w artykułach:
(01/97) WOKÓŁ RYTÓW Z CÔA
(02/97) TRANSGENICZNA ŻYWNOŚĆ
(03/97) ODPORNOŚĆ KONTROLOWANA
(04/97) POMIDOR PRZECIW WŚCIEKLIŹNIE, BANAN PRZECIW MALARII
(04/97) TRANSGENICZNE STRACHY
(08/97) WINO GENETYKÓW