Twoja wyszukiwarka

GRZEGORZ BARTOSZ
WALKA O PRZETRWANIE
Wiedza i Życie nr 11/1997
Artykuł pochodzi z "Wiedzy i Życia" nr 11/1997

AŻ 95% NIEPOWODZEŃ W LECZENIU NOWOTWORÓW ZWIĄZANYCH JEST Z TAJEMNICZYM WCIĄŻ ZJAWISKIEM OPORNOŚCI NA LEKI. W SKALI ŚWIATA OZNACZA TO CO ROKU KILKA MILIONÓW ISTNIEŃ LUDZKICH.

Przyczyny oporności na leki przeciwnowotworowe są różnorodne, jednak u podłoża większości przypadków leżą białka obecne w błonach komórek nowotworowych, które wyrzucają leki z tych komórek, choć wcale nie przeszkadzają im się tam dostać. Biofizyk ujmie to bardziej precyzyjnie - chodzi o białka aktywnie transportujące na zewnątrz komórek dostające się do nich leki, przy czym "aktywnie" oznacza tyle, że potrzebna jest do tego energia zmagazynowana w ATP (kwasie adenozynotrifosforowym), zwanym potocznie paliwem komórkowym. Białka te należą do specjalnej rodziny białek transportowych określanych mianem transporterów ABC (ang. ATP-Binding Cassette).

Już w latach sześćdziesiątych zauważono, że w komórkach nowotworowych opornych na daunorubicynę stężenie tego leku w cytoplazmie jest niższe niż w komórkach wrażliwych. Kilka lat później - badając komórki jajnika chomika chińskiego - zauważono, że w błonach plazmatycznych komórek opornych na inny lek, kolchicynę, znajduje się znacznie więcej jednego z białek niż w pozostałych komórkach. Skojarzenie tych dwóch obserwacji doprowadziło do hipotezy, że właśnie to białko, zmniejszając przepuszczalność błony plazmatycznej dla leków, decyduje o oporności. Nazwano je więc glikoproteiną P, od angielskiego słowa permeability - przepuszczalność.

Wkrótce okazało się, że początkowy wniosek był błędny. Glikoproteina P wcale nie zmniejsza przepuszczalności błony dla leków, w każdym razie nie tworzy biernej bariery przepuszczalności. Z analizy sekwencji aminokwasów wynikało, że białko to należy do rodziny transporterów ABC. Należało więc oczekiwać, że raczej transportuje leki, wyrzucając je na zewnątrz komórek, niż zapobiega ich wnikaniu. Przypuszczenie to zostało potwierdzone podczas wykorzystania tzw. odwróconych pęcherzyków, bardzo przydatnych w badaniach transportu przez błony. Odwrócone pęcherzyki są to fragmenty błony komórkowej ukształtowane przez eksperymentatora w ten sposób, że wewnętrzna (kontaktująca się z cytoplazmą) powierzchnia błony znajduje się na zewnątrz pęcherzyka, natomiast zewnętrzna powierzchnia błony komórkowej w jego wnętrzu. Jeśli wydaje się to zbyt skomplikowane, warto przypomnieć sobie zabawy z dzieciństwa - wepchnięty palcem do środka fragment niezbyt twardej gumowej piłki tworzy właśnie coś w rodzaju odwróconego pęcherzyka. Taki pęcherzyk działa dokładnie przeciwnie niż błona plazmatyczna w komórce: aktywny transport wyrzucający substancję z komórki jest skierowany do wewnątrz odwróconego pęcherzyka. Jeśli glikoproteina P wypompowuje z komórki leki, to będzie je gromadzić w odwróconych pęcherzykach błonowych. Okazało się, że jest tak istotnie, o ile do preparatu pęcherzyków dodamy ATP.

ZŁOWROGA POMPA

W nauce już tak jest, że każde wyjaśnienie rodzi następne znaki zapytania. Jeśli glikoproteina P jest aktywnym transporterem leków, to powstaje pytanie: jak działa taki transporter? I jest ono o tyle niebanalne, że glikoproteina P usuwa z komórek bardzo wiele różnych związków, niekiedy zupełnie do siebie niepodobnych. Wprawdzie mają one pewne cechy wspólne - wszystkie są dość hydrofobowe, zwykle mają co najmniej jeden pierścień aromatyczny, wiele z nich ma ładunek dodatni - są to jednak tylko bardzo ogólne podobieństwo. Fakt, że glikoproteina P jest tak mało "wybredna", tłumaczy zjawisko oporności wielolekowej, czyli niewrażliwości na leki o niekoniecznie zbliżonej strukturze. Niestety, przyczyna tego zjawiska pozostaje niezrozumiała. Żaden znany dotychczas transporter nie był aż tak mało specyficzny. W jaki więc sposób glikoproteina P rozpoznaje związki, które usuwa z komórek? To prawdziwa zagadka biofizyczna.

Jedna z propozycji rozwikłania tej zagadki zakłada, że glikoproteina P nie jest klasyczną pompą (czyli białkiem aktywnie transportującym cząsteczki z roztworu wodnego po jednej stronie błony do roztworu wodnego po drugiej stronie błony), lecz tzw. flipazą.

W badaniach transportu przez błony bardzo przydatne są odwrócone pęcherzyki - fragmenty błony plazmatycznej zamknięte w ten sposób, że wewnętrzna (kontaktująca się z cytoplazmą) powierzchnia błony znajduje się w nich na zewnątrz, a zewnętrzna powierzchnia błony jest wewnątrz pęcherzyka. Transport odbywający się na zewnątrz komórki (usuwanie substancji) jest skierowany do wnętrza pęcherzyka (gromadzenie substancji w pęcherzyku)

Flipaza to białko działające wewnątrz błony, które przerzuca cząsteczki z jednej połówki dwuwarstwy lipidowej błony komórkowej do drugiej. Ma to znaczenie, ponieważ związki poddające się działaniu glikoproteiny P są w pewnym stopniu hydrofobowe, a więc częściowo gromadzą się w błonach. Można przypuszczać, że cząsteczki tych związków znajdujące się na zewnątrz komórki pozostają w równowadze z cząsteczkami rozpuszczonymi w zewnętrznej połówce dwuwarstwy lipidowej błony plazmatycznej otaczającej komórkę, zaś cząsteczki znajdujące się w cytoplazmie - z cząsteczkami rozpuszczonymi w wewnętrznej połówce dwuwarstwy lipidowej błony plazmatycznej. Jeśli glikoproteina P istotnie jest flipazą, to, przerzucając leki z wewnętrznej do zewnętrznej połówki błony, będzie zwiększać stężenia leku na zewnątrz komórki. Przy czym wcale nie musi wykazywać wysokiej specyficzności - po prostu wyrzuca z wewnętrznej połówki dwuwarstwy lipidowej do połówki zewnętrznej wszystkie podejrzane cząsteczki, jakie tam znajdzie. Działa jak sumienny, sprawny, choć ograniczony ochroniarz.

Inna hipoteza nawiązuje do bariery przepuszczalności, którą to rolę przypisano glikoproteinie P zaraz po jej odkryciu. Teraz jednak chodzi o barierę czynną, a nie bierną. Zgodnie z tą hipotezą, glikoproteina P działa jak molekularny odkurzacz: wysysa z błony wszystkie nie pasujące do niej cząsteczki i aktywnie wyrzuca je na zewnątrz, zanim jeszcze zdążą przeniknąć przez błonę do cytoplazmy. Są jeszcze inne hipotezy, ale jak jest naprawdę, ciągle nie wiemy.

WINNYCH JEST WIĘCEJ

Badacze zajmujący się lekoopornością powoli przywiązali się do myśli, że wszystkiemu winna jest glikoproteina P. Zaskoczeniem było więc odkrycie, że pewne linie komórkowe wykazujące oporność wielolekową i mające obniżone stężenie leków w cytoplazmie nie zawierają glikoproteiny P. Dalsze badania wyjaśniły, że w takich komórkach znajduje się inne, choć podobnie działające, białko z rodziny transporterów ABC. Nazwano je białkiem związanym z opornością wielolekową (ang. Multidrug Resistance-Associated Protein, stąd skrót MRP). MRP różni się znacznie budową od glikoproteiny P, a różnicom struktury wydaje się odpowiadać odmienność mechanizmu działania.

Jak działa glikoproteina P? Różne hipotezy traktują ją jako pompę leków (u góry, z lewej), flipazę przerzucającą leki z wewnętrznej do zewnętrznej połówki dwuwarstwy lipidowej (u góry, z prawej), molekularny odkurzacz usuwający z błony wszystkie obce substancje (na dole, z lewej) lub kanał chlorkowy (na dole, z prawej) bądź regulator kanału chlorkowego, zmieniający różnicę wartości pH i różnicę wartości potencjału elektrycznego (y) po obu stronach błony, a wskutek tego - rozkład leków między komórką i jej otoczeniem

We wszystkich komórkach występuje w dość dużych stężeniach - kilku milimoli na litr - glutation, mały peptyd zbudowany z trzech reszt aminokwasowych. Pełni on rozmaite funkcje obronne. Jest przeciwutleniaczem chroniącym komórki przed stresem oksydacyjnym w ten sposób, że zamiast ważniejszych składników komórki on sam ulega utlenieniu. Potrafi też unieszkodliwić różne reaktywne związki, łącząc się z nimi. Od wielu lat wiadomo było, iż powstające w ten sposób tzw. koniugaty glutationu są usuwane z komórek, ale transportujące je białko było nieznane. Okazało się, że jest nim właśnie MRP i usuwa ono z komórek także inne koniugaty substancji szkodliwych, m.in. ich połączenia z kwasem glukuronowym. Zaobserwowano ponadto, że obniżenie w komórkach poziomu glutationu hamuje usuwanie cytostatyków przez MRP, choć nie wpływa na funkcję glikoproteiny P. Stąd wniosek, iż MRP wyrzuca z komórek leki przeciwnowotworowe w postaci kompleksów z glutationem. Dotychczas powstawania takich połączeń nie stwierdzono.

Podobnie jak w przypadku glikoproteiny P, powstało kilka hipotez, które mają wyjaśnić mechanizm działania MRP. Jedna z nich zakłada, że w komórkach istnieją tak nietrwałe połączenia leków z glutationem, iż nie można ich wykryć typowymi metodami analitycznymi. Inna postuluje, że cząsteczka MRP ma dwa miejsca wiążące: jedno dla glutationu, drugie dla cząsteczki hydrofobowego leku. Oba miejsca muszą być zajęte, aby nastąpił transport; nie jest jednak istotne, czy cząsteczki zajmujące oba miejsca są ze sobą połączone. MRP działałoby jak właściciel hotelu wynajmujący pokoje dwuosobowe wyłącznie parom, nie interesując się jednak zupełnie, czy pary te coś ze sobą łączy.

Aby sprawę skomplikować jeszcze bardziej, powiedzmy otwarcie - wcale niewykluczone, że istnieją i inne białka transportowe związane z opornością na leki. Genom ludzki nie został jeszcze przecież w pełni rozszyfrowany, może więc kryje tajemnicę innych transporterów ABC? Ale i bez tego sprawa jest wystarczająco zagmatwana. W zjawisku oporności wielolekowej uczestniczą bowiem nie tylko transportery, ale i inne białka. Jednym z nich jest białko określane skrótem LRP (Lung Resistance Protein - białko oporności płuc), wykryte w komórkach pochodzących z tego narządu. Jego funkcja nie jest jasna. W myśl jednej z koncepcji współtworzy ono struktury zamykające pory w otoczce jądrowej, zamykając lekom dostęp do jądra komórkowego.

PEŁNA MOBILIZACJA

Dlaczego złowrogie pompy, glikoproteina P lub MRP, pojawiają się w komórkach nowotworów? Przecież nie po to, żeby utrudnić pracę lekarzom. Dla fizjologa odpowiedź jest prosta. Ponieważ białka te występują w normalnych komórkach naszego ciała, zawierać je będą także wywodzące się z nich linie komórek nowotworowych. Normalnie najwięcej glikoproteiny P znajduje się w komórkach tkanek pełniących funkcje wydzielnicze, takich jak nadnercza czy śluzówka jelita. Jest też obecna w śródbłonku naczyń włosowatych mózgu i jąder, w łożysku, płucach, gruczole krokowym i w żołądku, a także w limfocytach. MRP występuje jeszcze bardziej powszechnie - jest praktycznie we wszystkich komórkach organizmu.

Niewątpliwie oba białka pełnią normalne, "pokojowe" funkcje fizjologiczne. Prawdopodobnie uczestniczą w transporcie produktów przemiany materii. Glikoproteina P, być może, transportuje hormony sterydowe, a na pewno uczestniczy w utrzymaniu bariery krew-mózg, chroniącej mózg przed związkami trującymi. MRP transportuje zapewne koniugaty różnych metabolitów z glutationem czy kwasem glukuronowym, a także uczestniczy w usuwaniu z komórek obcych związków, sprzęganych z glutationem lub kwasem glukuronowym przez enzymy obronne. Na działanie takich związków nasze komórki ciała są wciąż narażone. Jest ich wiele zwłaszcza w pożywieniu pochodzenia roślinnego. Rośliny wytwarzają różnorodne substancje, które lepiej jak najszybciej unieczynnić i usunąć z komórek. Takich substancji zjadamy dziennie około pół grama.

Dwie pompy usuwające leki przeciwnowotworowe z komórek: glikoproteina P, białko zbudowane z 1280 reszt aminokwasowych, o masie cząsteczkowej około 170 kilodaltonów, przebijające 12 razy dwuwarstwę lipidową (z lewej) i białko MRP związane z opornością wielolekową (Multidrug Resistance-Associated Protein), zbudowane z 1531 reszt aminokwasowych, o masie cząsteczkowej około 190 kilodaltonów, przebijające dwuwarstwę lipidową prawdopodobnie 18 razy (z prawej)

Zarówno glikoproteina G, jak i MRP występują w normalnych komórkach w ilościach niezbyt dużych. W warunkach fizjologicznych przechowywanie większych zapasów zwyczajnie się nie opłaca, ponieważ potrzeba na to zbyt dużo energii. Dlaczego więc w komórkach nowotworowych obu białek jest znacznie więcej? Niektóre nowotwory cechują się spontanicznie podwyższoną ekspresją glikoproteiny P. W większości jednak wzmaga się ona pod wpływem leków. Te komórki nowotworowe, w których jest więcej glikoproteiny P, mają przewagę nad innymi - są mniej wrażliwe na stosowane leki, mogą więc rosnąć i dzielić się w ich obecności, mimo iż bardziej wrażliwe komórki nowotworu zamierają. Z czasem w populacji komórek nowotworowych zaczynają przeważać komórki lekooporne o znacznie zwiększonej zawartości transporterów ABC. Ich zapotrzebowanie na jakże cenne ATP jest oczywiście znacznie większe, ale główny księgowy machnąłby na to ręką, rozumiejąc, że jest to stan wyższej konieczności. Zatem chory walczy o życie, przyjmując leki, ale komórki nowotworowe też walczą o przetrwanie, wyrzucając te leki ze swego wnętrza.

CO DALEJ?

Mimo wielu niepowodzeń chemioterapia jest na tyle obiecującą metodą leczenia nowotworów, że warto podejmować wysiłki zmierzające do opanowania zjawiska oporności na leki. Trwają poszukiwania związków, które skutecznie zahamują działanie pomp "wysysających" leki z wnętrza komórki. Zwykle substancje tego typu - modyfikatory oporności wielolekowej - same są substratami glikoproteiny P lub MRP, białek tak mało wybrednych w doborze substratów. Pompy wielolekowe mają małą selektywność. Próbują więc usunąć zarówno cząsteczki leku, jak i cząsteczki modyfikatora, w zależności od tego, które z nich staną na ich drodze. Ta cała sytuacja przypomina zatłoczony sklep, w którym obok kupujących (cząsteczki cytostatyka) pchają się ciekawscy, chcący tylko obejrzeć towar (cząsteczki modyfikatora). Im więcej ciekawskich, tym mniej klientów może obsłużyć sprzedawca (pompa wielolekowa). Jednym ze skuteczniejszych modyfikatorów glikoproteiny P jest cyklosporyna A, ta sama, której używa się dla osłabienia reakcji odpornościowych u biorców przeszczepów narządów. Niektóre pochodne cyklosporyny są tu jeszcze bardziej skuteczne, a mniej szkodliwe dla zdrowych komórek. Cyklosporyna A i jej pochodne wykazują słabsze działanie na MRP. Izoflawonoid genisteina działa z kolei skuteczniej na MRP niż na glikoproteinę P. Ciągle jednak poszukuje się nowych modyfikatorów - mniej toksycznych i bardziej skutecznych.

Być może, oporność wielolekową można osłabić także w inny sposób, na przykład stosując przeciwciała przeciwko pompom wielolekowym, które, wiążąc się swoiście z białkami transportowymi, hamowałyby ich działanie. Pomoc mogą także zapewnić oligonukleotydy antysensowe, które są "skrawkami" materiału genetycznego. Przeciwdziałając biosyntezie, glikoproteiny P lub MRP uniemożliwiłyby wyrzucanie leków z komórki, z powodu braku odpowiednich do tego celu transporterów. Badania nad takimi możliwościami są w toku.

Prof. GRZEGORZ BARTOSZ jest kierownikiem Katedry Biofizyki Molekularnej Uniwersytetu Łódzkiego.

O podobnych zagadnieniach przeczytasz w artykułach:
(09/97) SUPERBROŃ XX WIEKU