Twoja wyszukiwarka

JÓZEF DULAK
ODKRYWANIE PRZEZNACZENIA
Wiedza i Życie nr 10/2000
Artykuł pochodzi z "Wiedzy i Życia" nr 10/2000

Niedługo lekarze i pracodawcy dzięki technice PCR mogą uzyskać nieograniczony wgląd w nasze predyspozycje i obciążenia genetyczne.

Lekarz pobiera kroplę krwi z palca i rozprowadza ją na pasku bibuły. Bibułę umieszcza w szczelinie małego urządzenia i po kilku minutach z ekranu połączonego z nim komputera odczytuje wynik badania. Kolejne kilka minut zajmuje mu analiza i już jest gotowy do udzielenia pacjentowi informacji. Okazuje się, że chory jest nosicielem kilku bardzo rzadkich mutacji genów, których aktywność może doprowadzić za kilka lub kilkanaście lat do rozwoju poważnej choroby układu krążenia, chyba że od zaraz zacznie stosować właściwą dietę i zmieni dotychczasowy niezdrowy tryb życia.

Podobieństwa i różnice

Ta historyjka niekoniecznie musi pozostać wytworem fantazji. Niewykluczone, że za kilkanaście lat rutynowa analiza genetyczna, wykonana w trakcie okresowej wizyty u lekarza, pozwoli nie tylko ujawnić przyczyny obecnych dolegliwości, ale także przewidzieć przyszłe problemy zdrowotne i skutecznie im zapobiegać. Na poczekaniu będzie można ustalić, czy i jaki wirus spowodował bóle wątroby, jaka bakteria jest przyczyną powtarzających się od dłuższego czasu ataków kaszlu, a nawet ewentualne zagrożenia zdrowotne dzieci, których przyjście na świat dopiero planujemy. Nadzieję na to daje szybki rozwój medycyny molekularnej, która umożliwia śledzenie zmian chorobowych w organizmie człowieka na poziomie kwasów nukleinowych.

Pierwsze próby bezpośredniego badania kwasów nukleinowych dla celów diagnostycznych podjęto w latach siedemdziesiątych. Opracowane zostały wówczas techniki wykrywania DNA i RNA przez zastosowanie tzw. hybrydyzacji, czyli łączenia się podobnych nici kwasów nukleinowych. Dzięki zdolności kwasów nukleinowych do hybrydyzacji możliwe jest m.in. stwierdzenie, czy w badanym narządzie znajduje się poszukiwany wirus. Metoda jest też wykorzystywana do wykrywania zmian w chromosomach, powodujących choroby dziedziczne czy nowo-tworowe.

Kolejnym krokiem w diagnostyce molekularnej było użycie enzymów restrykcyjnych. Są to białka bakteryjne, które rozpoznają charakterystyczne układy (sekwencje) kilku nukleotydów i przecinają DNA w obrębie takiej sekwencji lub w pewnej ściśle określonej odległości od niej. Stosując ten rodzaj badań, można np. odróżnić fragment DNA kodujący prawidłową hemoglobinę od zmienionego genu, który jest przyczyną anemii sierpowatej.

Igła w stogu siana

Prawdziwy przełom w diagnostyce molekularnej nastąpił jednak dopiero pod koniec lat osiemdziesiątych. Pojawiła się wówczas metoda, nazywana reakcją łańcuchową polimerazy, czyli PCR (Polymerase Chain Reaction), która bardzo szybko włączona została do arsenału podstawowych technik biologii molekularnej, za jej twórca, Karl Mullis, otrzymał w 1993 roku za swoje odkrycie Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii.

PCR wykorzystywana jest przede wszystkim do szybkiej diagnostyki chorób zakaźnych, pozwala bowiem wykryć nawet pojedyncze cząsteczki wirusa. Dzięki tej właściwości metoda jest czasem określana jako "szukanie igły w stogu siana", ale jest to porównanie mylące. Ten szczególny rodzaj poszukiwań nie kończy się w chwili znalezienia "igły" podczas reakcji PCR powstają niezliczone kopie interesującego nas fragmentu DNA, więc z ich dostrzeżeniem nie ma żadnego problemu. Zamiast stogu siana mamy więc stóg igieł!

Trudno przecenić znaczenie PCR, szczególnie kiedy zależy nam na szybkim wykryciu zakażenia wirusowego, zanim zainfekowany organizm wytworzy tyle przeciwciał, żeby można było je wytropić metodami immunologicznymi. W przypadku bardzo groźnego wirusa HIV tradycyjne metody skuteczne są dopiero po około trzech miesiącach od chwili zakażenia. Równie długo trzeba czekać na wytworzenie większej ilości przeciwciał przy zakażeniach wirusami Hepatitis, które są odpowiedzialne za tzw. żółtaczki wszczepienne. A dzięki testom opartym na PCR robi się to natychmiast, można więc powstrzymać szerzenie się infekcji.

Wykrycie konkretnego czynnika zakaźnego ułatwia wybór leczenia, jak również sprawdzenie jego skuteczności. Jeśli PCR nie wykryje w organizmie chorego obcego DNA lub RNA, oznacza to, że zarazki zostały wyeliminowane, co jest niepodważalnym potwierdzeniem słuszności wyboru kuracji.

Zaletą metody jest także jej bezpieczeństwo dla prowadzącego badania. W odróżnieniu bowiem od hodowli wirusów czy bakterii, podczas PCR namnażany jest nie cały patogen, tylko fragment jego materiału genetycznego, który sam w sobie nie stanowi żadnego zagrożenia dla osoby wykonującej badania.

PCR znajduje również zastosowanie w diagnostyce prenatalnej. (Notabene wiele osób utożsamia diagnostykę molekularną z diagnostyką prenatalną, choć ta ostatnia jest tylko jednym z możliwych zastosowań technik molekularnych w diagnostyce). PCR wykonany jeszcze przed urodzeniem dziecka pomaga ustalić, czy płód obarczony jest ciężką wadą metaboliczną lub genetyczną. Badaniu poddaje się wówczas materiał genetyczny z komórek płodu, pobrany np. z płynu owodniowego. Dziś nie jest to już tylko wiedza dla samej wiedzy. W niektórych przypadkach, np. złożonych niedoborów odporności lub niezgodności czynnika Rh, odpowiednio wczesne wykrycie zagrożenia umożliwia wykonanie przeszczepu szpiku lub leczniczych przetoczeń krwi w łonie matki.

Jeszcze szerszego zastosowania diagnostyki molekularnej można się spodziewać w związku z rozpowszechnieniem zapłodnienia in vitro. Taki sposób diagnozy prenatalnej może być jednak wykorzystywany do budzącego u wielu osób opory badania płci zarodka i eliminacji takich, których płeć nie odpowiada oczekiwaniom.

Zdążyć przed rakiem

Nie rodzi natomiast takich sprzeciwów używanie PCR do wykrywania u dzieci czy osób dorosłych predyspozycji do chorób, którym można obecnie skutecznie zapobiegać, np. do badania ryzyka rozwoju chorób nowotworowych, jak też ich wczesnego wykrywania w stadium, które można skutecznie leczyć.

Zastosowanie enzymów restrykcyjnych do wykrywania mutacji powodującej anemię sierpowatą

Nowotwory mają, jak wiadomo, złożone podłoże genetyczne, ale często udaje się znaleźć jeden charakterystyczny tzw. marker molekularny dla danej choroby. W ten sposób np. wczesne wykrycie tzw. chromosomu Philadelphia, czyli krótszego chromosomu 22. pary, pozwala prawidłowo rozpoznać jeden z rodzajów białaczek i rozpocząć odpowiednie leczenie. Do chwili wprowadzenia PCR stosowano w tym celu badania cytogenetyczne, polegające na obserwacji całych chromosomów w hodowanych w laboratorium komórkach krwi.

Duże zainteresowanie budzi obecnie wykorzystanie diagnostyki molekularnej w wykrywaniu predyspozycji do raka jelita grubego czy raka piersi. W pewnych przypadkach, gdy nowotwory te już występowały w danej rodzinie, odpowiednio wcześnie wykonana diagnoza molekularna pozwala przewidywać, jaka przyszłość czeka badaną osobę. Wiadomo, iż obecność mutacji w genie APC u pacjenta, u którego w jelicie stwierdzono występowanie polipów, jest uzasadnieniem do wykonania zabiegu usunięcia tego fragmentu przewodu pokarmowego. Mutacje w genie APC sprawiają bowiem, iż polipy takie w miarę upływu czasu przekształcą się w nowotwór złośliwy.

Wbrew wcześniejszym, zbyt pochopnym opiniom, sytuacja w przypadku mutacji w genie BRCA1, związanym z dziedziczną postacią nowotworu piersi i jajnika, nie jest aż tak klarowna. Dlatego wykrycie mutacji w tym genie nie jest jednoznaczne z zaleceniem wykonania profilaktycznych operacji. Trwają badania nad znalezieniem właściwych kryteriów diagnozy i postępowania z kobietami obarczonymi mutacją w genie BRCA1 i drugim z tej samej rodziny genie BRCA2. Być może przedstawione przykłady diagnostyki molekularnej wywołają u czytelników wątpliwości, czy opisana na wstępie wizji przyszłości ma szanse stać się rzeczywistością. Stosowane obecnie metody, choć bardzo czułe i szybkie, zajmują czasem nawet do kilku dni. W laboratoriach wielu firm biotechnologicznych prowadzone są jednak badania, które szybkimi krokami zbliżają nas do możliwości przedstawionych na wstępie. Opracowywane są np. nowe, zminiaturyzowane aparaty do wykonywania reakcji PCR, które przeprowadzają odpowiednią analizę w ciągu kilkunastu minut. Przyszłość należy do tzw. genetycznych układów scalonych (DNA-chips), o których szerzej pisaliśmy niedawno .

Korzyści i zagrożenia

Diagnostyka molekularna była od dawna oczekiwanym narzędziem pomagającym lekarzom w postawieniu właściwej diagnozy. Trudno bez niej wyobrazić sobie nowoczesne laboratoria zajmujące się wykrywaniem chorób zakaźnych czy nowotworowych. Zdrowie, a często i życie pacjenta zależy bowiem od wczesnego wskazania przyczyny choroby i rozpoczęcia właściwego leczenia. Stosowane coraz powszechniej testy molekularne powinny ograniczyć zakażenia wirusami podczas transfuzji krwi czy przeszczepiania narządów.

Jest jednak jeszcze druga strona medalu. Tak potężne narzędzie w rękach badaczy może stwarzać złudne przekonanie, że należy je wykorzystywać w każdej sytuacji. Wspomniałem już o operacjach pochopnie zalecanych kobietom, u których wykryto mutacje w genie związanym z dziedziczną formą raka piersi. Duże obawy budzi także możliwość wykorzystywania informacji o zagrożeniu chorobami przez towarzystwa ubezpieczeniowe czy pracodawców. Rodzą się także obawy, że takie badania mogą doprowadzić do dyskryminacji pewnych grup społecznych, u których częściej występują pewne choroby genetyczne. Tak jest np. w przypadku Żydów aszkenazyjskich, wśród których w Stanach Zjednoczonych wykryto większą niż wśród innych grup ludności częstość występowania dziedzicznej mutacji w genie BRCA1.

Badanie DNA może być przeprowadzone w każdym okresie życia. Szczególną wrażliwość należy jednak zachować przy podejmowaniu takich badań u dzieci, zwłaszcza wtedy, gdy diagnoza dotyczy chorób ujawniających się w wieku dorosłym, a których nie można jeszcze skutecznie leczyć ani im zapobiegać. Badania takie są absolutnie niewskazane np. w sytuacji, gdy mają jedynie dostarczyć informacji rodzicom, zainteresowanym, jakie geny przekazali potomstwu.

PCR - co to takiego?

Podczas powielania DNA w komórce dochodzi do pęknięcia wiązań wodorowych łączących komplementarne nici, a następnie, przy udziale enzymów, z których najważniejsza jest polimeraza DNA, do każdej z tych nici dobudowywana jest potomna nić komplementarna. W wyniku powielania, zwanego także replikacją, z jednej cząsteczki macierzystego DNA powstają dwie cząsteczki potomne o identycznej budowie.

PCR to nic innego jak uproszczona replikacja DNA. Przeprowadzenie tej reakcji wymaga aparatu zwanego termocyklerem; próbki DNA, który chcemy namnożyć; enzymu - polimerazy, który tę reakcję przeprowadzi; nukleotydów niezbędnych do syntezy DNA oraz krótkich fragmentów jednoniciowego DNA, czyli starterów, od których rozpoczyna się synteza DNA. Potrzebna jest para starterów, które mają sekwencję nukleotydów taką, jak dwa końce odcinka DNA, który chcemy powielić.

Do niewielkich probówek wprowadzamy wymienione składniki zanurzone w odpowiednim buforze zapewniającym właściwy dla polimerazy skład jonów metali. Probówki umieszczamy w termocyklerze. Reakcja rozpoczyna się od podgrzania mieszaniny do temperatury około 95°C. Pękają wówczas wiązania wodorowe łączące dwie nici cząsteczki DNA. Etap ten trwa najwyżej kilka minut. Następnie odpowiednio zaprogramowany aparat obniża temperaturę do około 60°C, wtedy do pojedynczych nici macierzystego DNA przyłączają się startery. Zaraz potem do akcji wkracza polimeraza, która dołącza do starterów kolejne nukleotydy, zgodnie z zasadą komplementarności. W ten sposób w ciągu kilkudziesięciu sekund może zsyntetyzować się cała potomna nić DNA. Zatem po najwyżej kilku minutach z jednej wyjściowej cząsteczki DNA powstają dwie kopie fragmentu tej cząsteczki (rycina obok). Podczas PCR nie jest bowiem powielany cały dostępny materiał genetyczny, lecz jedynie jego fragment, złożony z około kilkuset nukleotydów. Dlatego w następnych cyklach (denaturacja, przyłączanie starterów, synteza DNA) dochodzi do zwielokrotnienia liczby krótkich cząsteczek DNA, ograniczonych z obu stron sekwencjami starterów.

Po 30 cyklach z jednej macierzystej cząsteczki DNA możemy uzyskać około 270 mln kopii. W rzeczywistości wydajność jest mniejsza, ale zważywszy na fakt, iż zazwyczaj mamy do czynienia ze znacznie większą wyjściową liczbą cząsteczek, uzyskujemy taką ilość DNA, którą można zobaczyć gołym okiem. Jest to możliwe po rozdzieleniu uzyskanego DNA. Podczas elektroforezy DNA przemieszcza się w żelu agarozowym lub poliakrylamidowym od bieguna ujemnego w kierunku dodatniego, z szybkością zależną od wielkości cząsteczki DNA małe cząsteczki wędrują szybciej, duże wolniej. Elektroforeza pozwala zatem oddzielić produkty przez nas oczekiwane od różnych zanieczyszczeń. Następnie za pomocą odpowiedniego barwienia można rozdzielone DNA uwidocznić i sfotografować.

Genetyczne abecadło

Zarówno DNA, jak i RNA zbudowane są z elementów zwanych nukleotydami.

Znamy kilka ich rodzajów - nazwy wywodzą się od zasad azotowych wchodzących w ich skład. W DNA mamy nukleotydy oznaczane literą A (adeninowy), literą C (cytozynowy), literą G (guaninowy) oraz literą T (tyminowy). Od początku lat pięćdziesiątych wiadomo również, że DNA jest cząsteczką składającą się z dwóch nici i zawsze naprzeciw nukleotydu A, w nici komplementarnej, znajduje się nukleotyd T, zaś naprzeciw nukleotydu G nukleotyd C. RNA jest cząsteczką jednoniciową i zamiast nukleotydu T występuje w niej nukleotyd oznaczony literą U (uracylowy). Jednak RNA również może się łączyć w struktury dwuniciowe, jeżeli spotka się z nim odpowiedni, komplementarny fragment jednoniciowego kwasu nukleinowego.

PCR służy do:

  • wykrywania zakażeń wirusowych, bakteryjnych, grzybiczych i pasożytniczych;
  • wczesnego wykrywania chorób dziedzicznych;
  • wykrywania predyspozycji do rozwoju nowotworów (np. raka jelita grubego, raka piersi);
  • wczesnego wykrywania nowotworów (np. białaczek);
  • badanie oporności na leki (bakterii na antybiotyki, komórek nowotworowych na chemioterapeutyki);
  • dopasowania dawców i biorców przeszczepów (np. szpiku kostnego);
  • ustalania ojcostwa;
  • wykrywania sprawców przestępstw (genetyczne "odciski palców").

Wiele osób utożsamia diagnostykę molekularną z diagnostyką prenatalną, tymczasem jest ona tylko jednym z możliwych zastosowań technik molekularnych w diagnostyce. Bada się tu materiał genetyczny rozwijającego się płodu, uzyskany najczęściej z płynu owodniowego. Można w ten sposób wykryć na przykład zespół Downa

Dr JÓZEF DULAK pracuje w Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego. Zajmuje się m.in. eksperymentalną terapią genową.