Twoja wyszukiwarka

JAROSŁAW BRYK
GENY, KTÓRE LECZĄ
Wiedza i Życie nr 8/2001
Artykuł pochodzi z "Wiedzy i Życia" nr 8/2001

Po dziesięciu latach doświadczeń terapia genowa dorobiła się zaledwie kilku sukcesów, wielu rozczarowań i jednej tragicznej śmierci. Mimo to nie cichną głosy o rewolucji medycznej. Jakie możliwości ma naprawdę ta "cudowna metoda"?

Jesse Gelsinger, osiemnastolatek z Arizony, cierpiał na nieuleczalną chorobę wątroby, która powodowała u niego ataki śpiączki, zanik mięśni i uciążliwe wymioty. Jego organizm nie radził sobie bowiem z rozkładaniem nie wykorzystanych aminokwasów. W tym procesie powstają toksyczne cząsteczki (jony amonowe), których nagromadzenie we krwi może prowadzić do uszkodzenia mózgu i śmierci. Wątroba przekształca jednak toksyczne jony w mocznik, który wydalany jest z moczem. Aby tak się stało, w reakcji musi uczestniczyć pewien enzym. Jeśli komórki wątroby go nie produkują, jak w przypadku Jessego, lub produkują go zbyt mało, mamy do czynienia z poważną chorobą.

Łagodzenie dolegliwości u pacjentów sprowadza się przede wszystkim do ograniczenia spożywania białka (co redukuje powstawanie jonów amonowych) oraz podawania leków umożliwiających częściowe ich usunięcie, dzięki czemu chorzy mogą prowadzić względnie normalne życie. Jesse Gelsinger był leczony w opisany wyżej sposób. Pod koniec 1999 roku zgłosił się jednak do Instytutu Terapii Genowej, działającego przy University of Pennsylvania, jako ochotnik do badań klinicznych nad swoją chorobą.

Jak działa terapia genowa?

Naukowcy uważali, że istnieje możliwość wyleczenia jego dolegliwości. Miałoby to polegać na dostarczeniu do komórek wątroby pacjenta dodatkowego, prawidłowego genu odpowiedzialnego za produkcję enzymu. Po takim zabiegu komórki wątroby powinny produkować "zdrowe" białko, które włączy się do cyklu przemian biochemicznych.

W każdej z naszych komórek znajduje się kilkadziesiąt tysięcy genów. Zapisana w nich informacja odczytana przez biochemiczną maszynerię komórki decyduje o działaniu całego organizmu. Produktem, który kodują geny, są najczęściej białka odpowiadające za poprawną budowę i funkcjonowanie komórki. Jeśli białko nie działa prawidłowo, to zwykle winny jest wadliwy gen, który przekazał złą instrukcję jego wytwarzania. I tu właśnie wkracza terapia genowa. Tą nazwą określa się procedury zmierzające do wprowadzenia do komórek pacjenta zdrowych odpowiedników wadliwie działających genów. Ich dostarczenie zazwyczaj likwiduje przyczyny choroby. Warto przy tym zwrócić uwagę, że nie jest to leczenie samych tylko objawów terapia genowa usuwa bowiem źródło problemu. To zadanie bardzo ambitne, ale też kuszące ogromnymi korzyściami dotąd opisano bowiem ponad 6 tys. dolegliwości będących skutkiem wad pojedynczych genów.

W ten sposób można by leczyć wiele chorób - nowotwory, AIDS, hemofilię, Parkinsona, Alzheimera. Trwają prace nad wykorzystaniem tych technik w schorzeniu wątroby, na które cierpiał Jesse Gelsinger.

Wektor znaczy przenośnik

Z oczywistych powodów nie możemy wyjąć całego narządu i do każdej jego komórki włożyć właściwy gen. Zakładamy, że wystarczy dostarczyć prawidłową kopię genu tylko do części komórek, ponieważ nawet niewielka produkcja tego enzymu przyniesie poprawę stanu zdrowia pacjenta. W jaki jednak sposób wprowadzić gen do chorej komórki? Na szczęście istnieje odpowiednie narzędzie zostało stworzone przez... naturę już bardzo dawno temu. To wirusy. Nauczyły się sprawnie infekować komórki gospodarza i wbudowywać swój materiał genetyczny w ich DNA, zmuszając je do wytwarzania kolejnych kopii wirusa. Gdyby więc zmodyfikować wybrany wirus, by zamiast swoich genów wstawiał do komórki prawidłowy gen, nie wywołując przy tym choroby, osiągnęlibyśmy nasz cel. Takie modyfikacje są możliwe dzięki wykorzystaniu współczesnych technik inżynierii genetycznej.

Wszelkie biologiczne narzędzia służące do przenoszenia genów nazywamy z łaciny wektorami, czyli nośnikami. Oprócz wirusów mogą to być też plazmidy (koliste cząsteczki DNA występujące u bakterii, zawierające m.in. geny oporności na antybiotyki). Dlatego wektory stosowane w terapii genowej dzielimy na dwie grupy: wirusowe i niewirusowe - te pierwsze dzięki znacznie większej wydajności infekcji wykorzystywane są zdecydowanie częściej.

Obecnie terapia genowa nie prowadzi do wymiany w komórkach "chorych" genów na "zdrowe". Byłaby to terapia idealna, ale niestety nie potrafimy jeszcze tego zrobić. Geny niesione przez obecnie stosowane wektory nie zastępują swoich wadliwych odpowiedników. Oprócz genu uszkodzonego, w komórce pojawia się także jego zdrowa kopia i to właśnie ona odpowiada za efekt terapeutyczny.

Większość wirusów nie wbudowuje się podczas infekcji w określone miejsce DNA gospodarza. Doświadczenia wskazują jednak, że choć istnieje ryzyko włączenia wirusa w prawidłowe geny i ich uszkodzenia to jest ono niewielkie. Wykorzystywanie wirusów to obecnie najlepsza technika, jaką dysponuje nauka. Dlatego właśnie do opisywanej wcześniej terapii wybrano wektor adenowirusowy. Zalety tego wektora przeważyły nad wadami, tym bardziej że adenowirusy preferencyjnie atakują komórki wątroby, co zwykle niekorzystne tu było efektem jak najbardziej pożądanym. W tej pierwszej fazie badań klinicznych uczestniczył wspomniany już Jesse Gelsinger. Eksperymenty, w których brał udział, miały na celu sprawdzenie efektu leczniczego u ludzi i ewentualnych efektów ubocznych nowej terapii.

Idealny wektor nie istnieje

Jesse Gelsinger nie żyje. 17 września 1999 roku, w ciągu 96 godzin od podania "leczniczych" wirusów, rozwinęła się u niego bardzo silna reakcja immunologiczna skierowana przeciwko adenowirusowi. Nie wiadomo jednak, dlaczego jego organizm zareagował tak silnie. Odpowiedział na infekcję bardzo wysoką gorączką i niekontrolowanym podniesieniem poziomu jonów amonowych we krwi. Jesse, będąc już w śpiączce, zmarł wskutek porażenia układu oddechowego. Jest pierwszym w historii chorym, który poniósł śmierć w wyniku terapii genowej. U żadnego z 17 innych pacjentów, razem z nim poddawanych leczeniu nie wystąpiła podobna reakcja, pomimo że dawka wirusa, którą otrzymał Jesse, nie odbiegała od pozostałych. Był to kubeł zimnej wody na głowy entuzjastów terapii genowej. Ponieważ wypadek nie był spowodowany błędem lekarzy ani niewłaściwym opracowaniem terapii, śmierć chłopca dobitnie uświadomiła niedojrzałość tej "cudownej techniki".

Każdy z wektorów wirusowych ma wady, które ograniczają jego stosowanie i grożą skutkami ubocznymi. Każdy z nich ma też cechy bardzo pożądane w terapii genowej. Prawdopodobnie nie powstanie "wektor idealny", którego można byłoby użyć w każdym przypadku. Wciąż jeszcze pozostaje także konieczność zbadania mechanizmów dostarczania genów przez wektory oraz regulacji ich działania w infekowanych komórkach. Badania trwają i na pewno nie ustaną, zwłaszcza że oprócz niepowodzeń znane są też pozytywne efekty terapii genowej ludzi.

Niezwykłe sukcesy

Przykładem pierwszych sukcesów mogą być próby ratowania dzieci z poważnie uszkodzonym układem immunologicznym. Choroby te są okrutne - dzieci pozbawione systemu chroniącego organizm przed drobnoustrojami mogą umrzeć wskutek najmniejszej infekcji. Żeby uchronić młodych pacjentów przed niechybną śmiercią, trzyma się ich w sterylnych warunkach - w plastikowych namiotach oddzielających od świata zewnętrznego. Nieleczeni i nieizolowani pacjenci zwykle umierają pół roku po urodzeniu z powodu nawracających infekcji.

U osób chorych na jeden z rodzajów uszkodzeń układu immunologicznego, gen o kluczowym znaczeniu dla limfocytów białych krwinek jest nieaktywny. Gen ten koduje białko, które umożliwia kontaktowanie się limfocytów ze sobą i reagowanie na sygnały. Brak tego białka czyni komórki niezdolnymi do pełnienia normalnej funkcji, jakby limfocyty były ślepe i głuche.

Co próbuje sie leczyć terapią genową? (liczba prowadzonych badań)
Zaawansowanie prac klinicznych nad terapią genową (liczba prowadzonych badań)

Szansę na skuteczną terapię dają stale dzielące się komórki macierzyste szpiku kostnego, z których mogą powstawać wszystkie typy komórek krwi. Można je dość łatwo pobrać od pacjenta, naprawić i wszczepić z powrotem, żeby dalej pełniły swoją funkcję, różnicując się w prawidłowe komórki układu immunologicznego.

W kwietniu ubiegłego roku ukazała się praca, której autorzy opisują przypadek terapii genowej dwojga dzieci z uszkodzonym układem immunologicznym. Pobrano od nich macierzyste komórki szpiku kostnego w hodowli laboratoryjnej, zainfekowano zmodyfikowanym retrowirusem, niosącym prawidłową wersję genu, a następnie tak zmienione komórki wszczepiono z powrotem chorym. Po dziesięciu miesiącach od opublikowania wyników dzieci wciąż pozostawały zdrowe. Do dziś żyją także dwie dziewczynki, które już w 1990 roku zostały po raz pierwszy w historii poddane terapii genowej. Cierpiały one na inną postać poważnego uszkodzenia układu odpornościowego; leczenie odbyło się nieco inną metodą, ale rezultaty są równie niezwykłe. Dzisiaj, w wieku kilkunastu lat, dzieci te prowadzą normalne życie, a fizjologiczne parametry ich systemu odpornościowego pozostają w normie.

Ubiegłoroczny sukces wynika w dużej mierze z postępu wiedzy i techniki, który umożliwił dopracowanie wszystkich stadiów eksperymentu. Czynniki, dzięki którym terapia się powiodła, to po pierwsze sam charakter choroby. W opisanym przypadku jest bowiem za nią odpowiedzialna grupa łatwych do izolacji i hodowli komórek. Po drugie dopracowanie warunków hodowli, możliwe dzięki większej wiedzy o biologii komórek macierzystych szpiku i po trzecie skuteczny i bezpieczny wektor. To rodzi nadzieję, że z innymi próbami będzie podobnie i że większa wiedza i doświadczenie doprowadzą do upragnionego sukcesu.

Lecznicze wirusy

  • Adenowirusy
    są odpowiedzialne za łagodne infekcje dróg oddechowych, czyli przeziębienie. Ich materiałem genetycznym jest DNA, atakują zarówno komórki dzielące, jak i nie dzielące się. Z wektorów adenowirusowych usuwa się geny niezbędne do namnażania, zastępując je fragmentem DNA, który chcemy użyć w celach terapeutycznych. Tak zmodyfikowany wirus wnika do jądra komórkowego, gdzie powoduje powstanie leczniczego białka, nie wbudowując się jednak w chromosomy gospodarza. Ponieważ wirus nie ma genu pozwalającego na namnażanie, nie zakaża innych komórek, co stanowi zabezpieczenie przed nie kontrolowanym powielaniem się wirusa. W laboratorium można jednak wyhodować ogro-mne ilości cząsteczek wirusowych, dzięki czemu możliwa jest infekcja wielu komórek pacjenta jednocześnie. Bardzo istotny jest fakt, że produkcja leczniczego białka osiąga w organizmie chorego poddanego terapii bardzo wysoki poziom. Niestety, wektor ten ma również bardzo poważną wadę wywołuje szybką i silną odpowiedź immunologiczną. Szacuje się, że ponad 55% populacji ma przeciwciała przeciwko adenowirusom nasz układ odpornościowy łatwo eliminuje więc zainfekowane komórki i samego wirusa, w ten sposób produkcja terapeutycznych białek nie trwa zwykle dłużej niż kilka dni.
  • Retrowirusy
    zawierają materiał genetyczny w postaci RNA. Do wytwarzania ich białek konieczne jest więc przepisanie informacji z RNA wirusowego na DNA i wstawienie go do genomu gospodarza. Dzięki temu białka produkowane są przez dłuższy czas (w obecnych eksperymentach do kilku tygodni), choć w niewielkiej ilości. Retrowirusy nie wywołują silnej reakcji immunologicznej, ale mają podstawową wadę, znacznie ograniczającą ich zastosowanie - infekują tylko komórki dzielące się. Żeby wykorzystać ten wektor do naprawy nie dzielących się komórek (np. mięśniowych), trzeba pobrać je od chorego, sztucznie zmusić do podziału w hodowli laboratoryjnej, zainfekować retrowirusem i z powrotem wszczepić je pacjentowi. Doświadczenia przeprowadzone na myszach pokazały jednak, że w ciągu tygodnia produkcja leczniczych białek ustaje. Mechanizm tego zjawiska pozostaje jak dotąd nie wyjaśniony. Ponadto wbudowywanie się wirusowego DNA w chromosom pacjenta niesie ryzyko uszkodzenia jednego z genów, co może wywołać groźne skutki. Dłuższy czas wytwarzania białek wirusowych jest jednak tak cenną cechą, że naukowcy nie rezygnują z prób ulepszania wektorów retrowirusowych, nawet mimo trudności, które sprawia ich obróbka laboratoryjna.
  • Wirusy związane z adenowirusami
    (AAV, ang. Adeno-Associated Virus) to niewielkie, niechorobotwórcze wirusy zawierające pojedynczą nić DNA i naturalnie pozbawione genów niezbędnych do namnażania. Do powielania się wymagają więc obecności innego wirusa, zwanego wirusem pomocniczym (najczęściej jest nim adenowirus stąd nazwa tej grupy patogenów). AAV infekujące komórki ludzkie wbudowują się w ściśle określone miejsce na chromosomie 19, nie wywołując niepożądanych objawów. Słaba jest także odpowiedź immunologiczna skierowana przeciwko AAV. Wirusy te są jednak niewielkie, więc terapeutyczny fragment DNA, który można wstawić w miejsce genów wirusowych jest od dwóch do prawie dziesięciu razy mniejszy niż u innych wektorów wirusowych. Ponadto wirus ze zmienionymi genami wbudowuje się w DNA biorcy z dużo mniejszą skutecznością i precyzją. Problemem jest także hodowla ponieważ nie może się on sam namnażać, komórki-inkubatory, w których produkuje się wirusy, muszą wytwarzać też białka adenowirusów. To zaś rodzi kłopoty przy oczyszczaniu AAV. Na domiar złego jedno z białek koniecznych do wyprodukowania cząstek wirusa jest toksyczne dla komórek-gospodarzy. Trudno więc wyhodować w laboratorium wirusy w wysokich stężeniach, co jest warunkiem stosowania ich jako wektorów.

Nie tylko wirusy

Pożądane geny można dostarczyć do komórek pacjenta, używając nagiego DNA i lipidów kationowych. Obydwa omówione systemy mają podstawową wadę porównaniu z wektorami wirusowymi są bardzo mało wydajne.

Nagi DNA to niczym nieosłonięta, kolista cząsteczka kwasu dezoksyrybonukleinowego, niosąca lecznicze geny. Wektor ten jest najskuteczniejszy po miejscowym podaniu do skóry i mięśni. U myszy produkcja kodowanych przez niego białek trwa w mięśniach nawet do kilku miesięcy. W innych tkankach z nieznanych dotąd przyczyn czas ten jest bardzo krótki. Nieznany jest też mechanizm pobierania nagiego DNA przez komórki. Białka kodowane przez tę klasę wektorów podanych do skóry lub mięśni wywołują silną odpowiedź immunologiczną. W przypadku wektorów wirusowych, mających wytwarzać lecznicze białka, jest to poważna wada, jednak w przypadku nagiego DNA ta właściwość jest zaletą. Wykorzystanie tego zjawiska do konstruowania tzw. szczepionek DNA, stosowanych m.in. w próbach leczenia nowotworów, to najbardziej obiecujące zastosowanie nagiego DNA.

Lipidy kationowe to pęcherzyki lipidowe, które elektrostatycznie wiążą na swojej powierzchni DNA. Ich działanie jest podobne do nagiego DNA, mają jednak krótki okres produkcji białka i są trudne w obróbce laboratoryjnej. Próbuje się wykorzystywać je w terapii nowotworów (przez zwiększanie ich wrażliwości na układ odpornościowy po miejscowym podaniu wektora) oraz w terapii mukowiscydozy, ciężkiej dziedzicznej choroby płuc (pacjenci inhalują aerozol zawierający wektor).

Terapia genowa w Polsce

Genetycznie modyfikowane szczepionki przeciwnowotworowe pobudzają układ odpornościowy pacjenta do rozpoznawania i niszczenia komórek nowotworowych, które normalnie pozostają bezkarne. Wbrew skojarzeniu ze słowem "szczepionka" nie pełnią funkcji profilaktycznej stosuje się je już po leczeniu chirurgicznym lub u pacjentów w późnym stadium choroby.

W Polsce od 5 lat prowadzone są jedne z pierwszych i najbardziej zaawansowanych w świecie badań nad genetycznie modyfikowaną szczepionką przeciw czerniakowi, bardzo złośliwemu nowotworowi skóry, na który w ostatnich czasach umiera coraz więcej ludzi.

Szczepionkę najczęściej przygotowuje się, mieszając dwa rodzaje komórek nowotworowych. Są to komórki nowotworu pobrane chirurgicznie od pacjenta i hodowane w laboratorium komórki czerniaka zmodyfikowane genetycznie. Te ostatnie otrzymuje się, zarażając je wektorem retrowirusowym, który niesie geny kodujące związki pobudzające układ odpornościowy. W dniu szczepienia oba rodzaje komórek miesza się ze sobą i naświetla promieniami UV, aby utraciły zdolność do podziału. Następnie wprowadza się je pacjentowi pod skórę. Układ immunologiczny rozpoznaje komórki hodowlane jako obce i mobilizuje się do ich zniszczenia. Ponieważ jednak są one bardzo podobne do komórek nowotworu pacjenta, układ odpornościowy (który dodatkowo pobudzają związki wytwarzane przez komórki zmodyfikowane genetycznie) zaczyna niszczyć także guza nowotworowego w organizmie chorego.

Jak wykazały pierwsze próby kliniczne, szczepionka nie jest toksyczna i nie wywołuje poważniejszych objawów ubocznych. Działanie terapeutyczne szczepionki to około 20?procentowe wydłużenie czasu przeżycia chorych. Należy tu zaznaczyć, że wszelkie próby kliniczne terapii nowotworów wykonuje się wyłącznie u pacjentów z najbardziej zaawansowanymi postaciami choroby, u których zastosowano już wszelkie konwencjonalne metody leczenia. Obecnie badania wkroczyły w ostatnią fazę prób klinicznych, w której na dużej grupie chorych zostaną zweryfikowane wcześniejsze, bardzo obiecujące wyniki.

>JAROSŁAW BRYK jest magistrantem w Zakładzie Genetyki Uniwersytetu Warszawskiego, przewodniczącym Koła Naukowego Biologii Molekularnej UW.